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在哺乳动物细胞中的敲入和敲除CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 Neurosc的部门
在哺乳动物细胞中的敲击和淘汰CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 1 1神经科学和细胞生物学部门，霍华德·休斯医学研究所，霍华德·休斯医学研究所，在纽约州纽约市纽黑文，纽约州纽黑文的蜂窝神经科学，神经变性和维修，纽约州纽黑文，纽约市210年6月210日，纽约市，纽约州。雪佛兰·蔡斯（Chevy Chase），医学博士，20815摘要该方案是为了帮助使用与上述出版物DPI相关的CRISPR/CAS9产生基因组和基因组编辑的哺乳动物细胞系（手稿尚未提交）。所需的缓冲液排序缓冲液1X DPB 0.02％EDTA 0.2％FBS敲除哺乳动物细胞系
将标记蛋白敲入 5'UTR 可高效生成稳定细胞系
摘要。表达标记蛋白的稳定细胞系和动物模型是研究细胞和分子行为的重要工具。已经应用了几种分子生物学技术来建立表达标记蛋白的细胞系，并取得了不同程度的成功和效率。在这里，我们应用 CRISPR/Cas9 将标记蛋白敲入内源基因位点的 5'UTR。通过这种 5'UTR 靶向敲入策略，建立了表达 Arl13b-Venus、Reep6-HA 和 EGFP-alpha-tubulin 的稳定细胞系，在抗生素选择的细胞中效率高达 50% 至 80%。敲入蛋白的定位与野生型细胞中内源蛋白的定位相同，并表现出均质表达。此外，从内源启动子敲入的 EGFP-alpha-tubulin 的表达在长期培养中是稳定的。我们进一步证明荧光信号足以进行长时间延时成像。在整个延时成像过程中，荧光信号清晰可见，并显示出特定的亚细胞定位。总之，我们的策略表明 5'UTR 是生成细胞系的合适位点，用于在哺乳动物细胞中稳定表达来自内源位点的标记蛋白。
优化的 CRISPR 介导的基因敲入揭示了 FOXP3 独立的人类 Treg 身份控制
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2021 年 1 月 17 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.16.426937 doi：bioRxiv 预印本
使用CRISPR介导的集成系统将转基因的靶向敲入转基因进入CHO细胞基因组
抽象的生物药物蛋白通常是通过培养重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞而产生的。高生产者细胞系从转染的细胞中筛选，并随机整合靶基因。由于转基因表达易受综合基因组基因座的周围环境的影响，因此应从大量具有异质转基因插入的重组细胞中选择生产者细胞系。相比之下，靶向集成在特征的基因组基因座中可以预测的转基因表达和较少的克隆变异性，因此可以预期稳定的靶蛋白产生。基于基于可编程核酸酶的基因组编辑技术最近已成为细胞基因组中靶基因座精确编辑的多功能工具。在这里，我们使用CRISPR/CAS9和CRISPR介导的精确整合到靶染色体（PIST）系统中，证明了将转基因的靶向敲入转基因的CHO细胞中的低黄嘌呤磷酸糖基转移酶（HPRT）基因座。我们还基于与同源性的靶向集成（HITI）系统生成了敲入CHO细胞。我们使用这些系统评估了转基因在HPRT基因座中的敲门效率。
基于CRISPR的靶向转基因敲入和基因校正的策略
引言定期插入了短期短篇小学重复序列（CRISPR）已彻底改变了转基因研究和人类基因疗法的领域1 - 6。使用CRISPR，可以将与人类疾病相关的特定遗传变异引入基因组中，也可以通过设计分别由细胞和生物体的设计中的野生型等位基因代替基因组中的突变，以进行基因敲入或基因校正7-12。然后可以研究CRISPR修饰的细胞和动物模型，以发现人类疾病和药物发现的基础机制13 - 15。因此，CRISPR具有巨大的翻译潜力。CRISPR技术已被探索用于体内基因疗法，以治疗各种人类遗传疾病16-18以及过体基因疗法以治疗血液疾病，可以通过将患者的细胞在其身体外的基因改造19-23。最近几年，提高了性能和超长的巨大进步，而疾病模型和基因疗法的CRISPR介导的基因插入和替代的潜力。
利用 CRISPR-Cas9 和 Cre-Lox 系统在天然启动子的控制下生成条件突变敲入
通过产生突变来调节基因活性对理解蛋白质功能做出了重大贡献。然而，突变分析通常使用过表达研究，其中蛋白质脱离了其正常的环境和化学计量。在目前的研究中，我们试图开发一种方法，同时使用 CRISPR/Cas9 和 Cre-Lox 技术来修改内源性 SAT1 基因，以引入蛋白质的突变形式，同时仍受其天然基因启动子的控制。我们通过转录终止元件克隆了野生型 (WT) SAT1 的 C 末端部分，并在关键结合位点包含点突变的相同版本 SAT1 前面与 LoxP 位点相邻。在 CRISPR/Cas9 诱导的 DNA 双链断裂后，通过非同源末端连接 (NHEJ) 将构建体插入内源性 SAT1 基因座。在确认插入事件不会改变 SAT1 的正常功能后，我们便能够通过引入 Cre 重组酶来评估点突变的影响。因此，该系统能够生成内源性 WT SAT1 可以有条件地修改的细胞，并允许在正常启动子和染色质调节的背景下研究位点特异性突变的功能后果。
利用牛胚胎靶向基因敲入的内源性修复机制
通过基因敲击将有用的特征引入牲畜育种计划已被证明具有挑战性。通常，在细胞系中进行了靶向插入，然后进行体细胞核转移克隆，这可能是效率低下的。一种替代方法是引入基因组编辑试剂和同源重组（HR）供体模板中的胚胎，以触发同源性定向修复（HDR）。然而，HR途径主要仅限于主动分裂细胞（S/G2相），其在合子中引入大型DNA序列的效率很低。同源介导的末端连接（HMEJ）方法已被证明可以提高非分散细胞的敲击效率，并在直接注射胚胎后利用HDR。将GRNA/CAS9核糖核蛋白复合蛋白复合物与传统的HR供体模板或牛zygotes中的HMEJ模板相结合时，将1.8 kb基因的敲门效率对比。与HR模板相比，HMEJ模板的基因敲入速率明显更高（37.0％和13.8％； P <0.05）。此外，超过三分之一的敲入胚胎（36.9％）是非摩萨剂。这种方法将促进牛基因组特定位置的基因构建体的一步引入，并有助于下一代精英牛。
引用方式：顾斌. 点亮胚胎：小鼠发育生物学的敲入报告基因生成. 动物繁殖. 2020;17(3):e20200055. https://doi.
发育生物学旨在了解单个细胞（受精卵）生成高度组织化的有机体的复杂调控过程。揭示这些过程本质的最有效方法是实时跟踪单个细胞和细胞谱系。成像设备、荧光标签和计算工具的最新进展使得对细胞和胚胎进行长期多色成像成为可能。然而，实现哺乳动物胚胎的实时成像仍面临一个重大挑战——生成携带报告基因的胚胎，以重现标记基因的内源性表达模式。基因组编辑技术的最新发展在实现高效生成报告小鼠模型方面发挥了重要作用。这篇简短的评论讨论了高效生成敲入报告小鼠的技术的最新发展以及这些模型在实时成像开发中的应用。随着这些发展，我们开始实现长期寻求的实时分析哺乳动物发育的前景。
CRISPR-Cas9 产生的庞贝氏症敲入小鼠模型表现出早发性肥厚性心肌病和骨骼肌无力
婴儿型庞贝病 (IOPD) 是由溶酶体酸性 α-葡萄糖苷酶 ( Gaa ) 突变引起的，表现为快速进展的致命性心脏和骨骼肌病，而合成的 GAA 静脉输注不能完全缓解这种症状。目前可用的小鼠模型不能完全模拟人类 IOPD，而是表现出骨骼肌病和晚发型肥厚性心肌病。由于该模型带有 Cre-LoxP 诱导的小鼠 Gaa 基因外显子破坏，因此也不适用于基于基因组编辑的治疗方法。我们报告了一种新型小鼠 IOPD 模型，该模型利用 CRISPR-Cas9 同源重组生成，携带直系同源 Gaa 突变 c.1826dupA (p.Y609 * )，从而导致人类 IOPD，并早期出现严重肥厚性心肌病。我们证明了使用单链寡核苷酸供体的双 sgRNA 方法对 Gaa c.1826 基因座具有高度特异性，并且没有基因组脱靶效应或重排。心脏和骨骼肌缺乏 Gaa mRNA 和酶活性，并积累了高水平的糖原。小鼠表现出骨骼肌无力，但没有经历早期死亡。总之，这些结果表明 CRISPR-Cas9 产生的 Gaa c.1826dupA 小鼠模型重现了人类 IOPD 的肥厚性心肌病和骨骼肌无力，表明其可用于评估新型疗法。
利用内源性修复机制实现牛胚胎的靶向基因敲入
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2020 年 6 月 12 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.06.09.143115 doi：bioRxiv preprint