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A3A 靶向转移治疗计算结果
A3A 靶向转移治疗 A POBEC 3A (A3A) 是人类最重要的脱氨酶之一，可使单链 DNA (ssDNA) 发生超突变。超突变与多种肿瘤-癌症转移进展有关 1-4 5-7 。已报道 APOBEC 依赖性癌症类型，如肺癌 8、9-11 、前列腺癌 12 、尿路上皮癌 13 、膀胱肿瘤 14 、卵巢鳞状癌 15、16 、乳腺癌 17 、子宫内膜异位症/宫颈癌 18、19 和头部 20 ，超突变酶也与某些自身免疫有关 21 。为了使 ssDNA 超突变，A3 酶诱导脱氧胞嘧啶随机脱氨为脱氧尿嘧啶 (dC-to-dU)，这已通过人工模拟得到证实 22 。人类 A3A 抑制已被提议作为一种干扰转移产生的可能治疗方法 23 。然而，A3A 抑制受到其他七种结构相关的人类 A3 酶 (A、B、C 24 、D、F、G 25 、H 和 AID 26 ) 存在的限制，这些酶具有生理/防御功能和可控诱变，例如抗体多样化 27 28 、肠细胞更新 29 30 、衰老 31 或抗病毒活性 32、33 34 。经晶体学和低温电子显微镜测定，大多数人类 A3 酶表现出具有相似 3D 结构的不对称同型二聚体（异型二聚体）结构（A 35 、B 36 、C 24 、F 37 、G 25 、H 38 、AID 26 ，表 S2 和图形摘要）。每个 A3 单体包含 ssDNA 结合所需的结构域和锌依赖性 dC 到 dU 脱氨的独立结构域。由于 A3A ssDNA 结合和二聚体界面的可能抑制剂探索很少 25 ，因此本文使用共同进化对接通过计算探索了这些可能的靶点。最终目标是探索任何与肿瘤转移有关的超突变的计算机干扰。这里采用了基于 Java 的 Data Warrior B uild E volutionary Library (DWBEL) 2-5 协同进化算法，作为筛选超大型类药库 39, 40 或从蛋白质序列 41-43 中预测机器学习对接模型的一种替代方法。具体而言，DWBEL 协同进化标准经过调整，可随机生成数万个原始子代，以选择数百个具有低纳摩尔亲和力的最佳无毒适配子代。类似的协同进化对接预测，当靶向其他蛋白质-配体对时，亲和力会更高。例如，针对耐药葡萄球菌的新型抗生素 44 、针对不动杆菌的 Abaucin 衍生物 45 、非人类抗凝血灭鼠剂 46 、猴痘 Tecovirimat 抗性突变体 47 、内腔 SARS omicron 48 、炎性冠状病毒 ORF8 蛋白 49 、人类 K + 通道的原核模型 50 、VHSV 弹状病毒的内腔 51 、疟疾环子孢子蛋白 47 、RSV 抗性突变体 52 和抗 HIV-Vif A3G 53 。
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
胞嘧啶基础编辑器针对马铃薯原生质体中的基因组编辑进行了优化
在这项研究中，我们生成并比较了三个针对马铃薯（卵巢结核）制成的胞苷碱基编辑器（CBE），该量子量其最多赋予了原生质体池中所有等位基因的43％C-T转换。早些时候，基因编辑的马铃薯植物是通过聚乙烯二烯介导的CRISPR/CAS9转化原生质体的转化而成功产生的。在一项研究中，通过用内源性马铃薯ST U6启动子替换U6-1启动子的标准拟南芥，从而获得了3 - 4倍的编辑效率。在这里，我们使用了这种优化的构建体（SP Cas9/ st u6-1 :: grna1，Target GRNA序列GGTC 4 C 5 TTGGAGC 12 AAAAAC 17 TGG）用于生成CBES量身定制的马铃薯，并测试了用于C-T碱基编辑的CBES在Granule-Bounchase-bound starch synthase 1 Gene中的C-T碱基编辑。首先，将链球菌CAS9转化为（D10A）Nickase（NCAS9）。接下来，来自人hapobec3a（A3a），大鼠（EVO_RAPOBEC1）（RA1）或Sea Lamprey（EVO_ PM CDA1）（CDA1）的三种胞质脱氨酶之一（cda1）与NCAS9和A尿素 - DNA Glycosylase融合了C-Encas9（CDA1）与每种模块化的链接。CBE的总体高度有效，A3A具有最佳的总体基础编辑活动，平均为34.5％，34.5％和27％的C-T转换为C4，C5和C12，而CDA1的平均基础编辑活动的平均基础编辑活性为34.5％，34％，34.5％，14.25％C4和C4，C4和C4，C4和C4，C4和C4，C4。ra1在C4和C5时表现出平均基础编辑活性为18.75％，19％的基础编辑活动，是唯一在C12时显示C-TO-T转换的基本编辑器。
人类造血干细胞的治疗性碱基编辑
利益冲突声明 作者声明存在经济利益冲突：详情可参见本文在线版。JKJ 在 Beam Therapeutics、Editas Medicine、Excelsior Genomics、Pairwise Plants、Poseida Therapeutics、Transposagen Biopharmaceuticals 和 Verve Therapeutics (f/k/a Endcadia) 拥有经济利益。麻省总医院和 Partners HealthCare 已审查并根据其利益冲突政策管理 JKJ 的利益。JKJ 是美国基因和细胞治疗学会董事会成员。JMG 和 JKJ 是描述本研究中使用的 A3A (N57Q) BE3 变体的专利申请的共同发明人。JKJ 还是描述基因编辑、碱基编辑和表观遗传编辑技术的各种专利和专利申请的共同发明人。JZ、YW 和 DEB 是与治疗性基因编辑技术相关的各种专利的共同发明人。
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人类DNA肿瘤病毒逃避尿素
估计全世界约有15％是由病毒引起的[1]。这些致癌病毒被归类为RNA（RTV）或DNA肿瘤病毒（DTVS）[1]。There are two human RTVs: hepatitis C virus (HCV) and human T-cell lymphotropic virus-1 (HTLV-1), and five human DTVs: human papilloma virus (HPV), hepatitis B virus (HBV), Epstein–Barr virus (EBV), Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), and默克尔细胞多瘤病毒（MCPYV）[1]。这些肿瘤病毒（TVS）建立了终身感染并使用多种策略逃避宿主免疫。并非所有电视感染都会引起疾病，既定潜伏期的病毒模式和持久性均干扰正常的细胞过程，有时会导致癌症[1]。特别有趣的是逃避尿嘧啶介导的抗病毒药物的机制，这可能对宿主基因组有害。尿嘧啶是一种非规范的DNA碱基，可以在补充过程中将其掺入DNA或通过单链DNA中的细胞氨酸而化学引入DNA，从而导致诱变u：g不匹配[2]。这些不匹配可以通过激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）/载脂蛋白B mRNA编辑催化性多肽蛋白（APOBEC）（APOBEC）来实现通过激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）/载脂蛋白B mRNA BRNA BRNA（APOBEC）[3]。AID和APOBEC3（A3）蛋白质的亚科分别在适应性和先天免疫反应中起作用。AID是B细胞成熟蛋白[4，5]，该蛋白在B淋巴细胞中表达，进入淋巴结中的生发中心。曾经成熟的B细胞退出生发中心，辅助表达返回到无法检测的水平。辅助活性仅限于表达免疫球蛋白基因的转录气泡，以使抗体库多样化。干扰素信号传导和促炎性细胞因子上调A3蛋白[3]。人类具有7种A3蛋白（A3a，A3b，A3C，A3D/E，A3F，A3G和A3H），可以靶向RNA，逆转录病毒新生cDNA或复制叉中的单链DNA [3]。AID/A3蛋白成功限制了RNA和DNA病毒[3]，包括一些RTV和DTV [3，6]。但是，RTV的A3限制已被确定为脱氨酶独立于脱氨酶[6，7]，即不是尿嘧啶介导的抗病毒免疫。因此，将不会更详细地讨论RTV。AID/A3尿嘧啶介导的抗病毒免疫通常被表示为“双刃剑”，因为这些有效的病毒限制子可能无法区分宿主和病毒基因组。因此，AID/A3蛋白在DTV发病机理中的作用引起了很大的关注。在这里，我们回顾了当前对DTV逃避尿嘧啶介导的抗病毒免疫的机制的知识。
apobecs：我们的善变的朋友？
载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽（APOBEC）家族指定多种胞苷脱氨酶。在哺乳动物中，至少5个基因编码Apobecs 1，2，3，4，而激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）[1，2]。A1酶是第一个被重新认可的酶，并且在特定宿主mRNA的组织特异性编辑中起着至关重要的作用[3]，但是尚未确定在病毒基因的诱变中的确认作用。人类已经扩增了APOBEC3（A3）基因座，以产生7个成员：A3A，A3B，A3C，A3D，A3D，A3F，A3G，A3G和A3H。所有APOBEC蛋白似乎与单链RNA或DNA或两者都结合[1，2]。apo-bec酶在细胞学上脱氨酸单链核酸，导致C-TO-U突变。当这些突变发生在重复病毒的减去链上时，结果是病毒和链的g- to-a转变。由于这些过渡通常会导致胡说八道或误导性突变，因此基本病毒基因产物的合成被阻断，传染性颗粒产量下降[1，2]。在反应中，病毒产生多种基因，干扰A3蛋白的功能。通常，这些是蛋白质拮抗剂，包括HIV-1 VIF的众所周知的例子，它充当了E3连接酶诱导某些A3脱氨酸酶的蛋白酶体降解的适配器[4-7]。此示例提供了明确的证据，表明A3基因的功能是干扰病毒复制。A3s在淋巴样和髓样细胞中似乎以较高的量表示[8-10]，这表明这些酶是病毒入侵的前线防御者。然而，其他细胞类型（例如乳腺细胞）也表达A3 [11]。由于某些A3被包装到病毒颗粒中，因此，A3S的病毒体掺入为摄入牛奶传播病毒的新生儿提供了额外的概念。尽管逆转录病毒DNA的脱氨基可能是病毒抑制的主要机制，但已经观察到了脱氨基依赖性的APOBEC活性模式[12，13]。由于A3S与包装到病毒体中的单链RNA结合，因此这些脱氨酶为病毒DNA合成提供了路障[13-15]。A3G还与HIV-1反向转纹酶（RT）相互作用，以干扰DNA复制[16]。不同的APOBEC可能已经演变为允许与RT以外的逆转录病毒酶结合。A3酶也已显示可分别抑制含DNA和RNA的病毒，例如人乳头状瘤病毒和冠状病毒[13-15]。APOBEC与其他病毒聚合酶的结合将为阻断各种病毒的复制提供充足的机会。