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AAV - 2025
会员 Smt。 Nandita Bhattacharya，Sc G Shri Vadivelan A，Sc F Smt。 Sangeetha Singhal，Sc F Smt。 Selvanayaki K、Sc F Shri Manu Jain、Sc F Shri Meshram Devendra、Sc F Shri Bineshkumar Kanakan、Sc F Smt。 Chandreyi S Ghosh，理科 F Shri Bheemappa，理科 F Dr. Tarun Uppal，理科 F Smt。 Seema Parmar，Sc F Shri Saugata Tribedi，Sc F Shri Vijay Vittal Nadagouda，Sc F Shri Bipin Kumar Lahkar，Sc F Shri Prafulla Chandra，Sc F Shri Manoj Kumar，Sc F Smt。 Dipti Dongre，Sc E Shri Vijaya Kumar M，Sc E Smt。 Bhavneet，Sc E Shri Subramanya N，Sc E Smt。 Chandrani Dey，Sc E Shri Reddy VSS，TO-D Shri Bheemapa HS Naik，TO-C Shri Nagesha D，TO-C Shri Nagaraja HS，TO-C Shri Prithvi V，TO-A
Revit™AAV增强剂：Rev UP AAV基因组生产...
引言近年来，注册临床试验的数量呈指数增长，该试验检查了使用重组AD AD相关病毒（基于AAV）的基因疗法的使用，部分原因是其能够有效地将基因传递给靶细胞具有最小副作用的靶细胞。FDA批准AAV疗法正在稳步增加，而在2023年已经宣布了两家AAV疗法，在撰写本文时，总数达到了5个[1-3]。 这些疗法代表了市场上最昂贵的药物，最昂贵的HEMIX®的价格为每剂量约为350万美元[4]。 高价点部分是由于缺乏产生足够AAV颗粒的有效方法。 给定的治疗可能需要10 11至10 16个病毒基因组[5]。 使用历史过程，大量的细胞堆或大型搅拌罐生物反应器可能只能每次运行产生少量剂量，这在这些疗法的制造中具有严重的瓶颈[6]。 因此，迫切需要改善AAV生产的总体过程，以减轻这些治疗的成本负担。 一个改进的区域是AAV基因疗法上游生产中的三重转染步骤。FDA批准AAV疗法正在稳步增加，而在2023年已经宣布了两家AAV疗法，在撰写本文时，总数达到了5个[1-3]。这些疗法代表了市场上最昂贵的药物，最昂贵的HEMIX®的价格为每剂量约为350万美元[4]。高价点部分是由于缺乏产生足够AAV颗粒的有效方法。给定的治疗可能需要10 11至10 16个病毒基因组[5]。使用历史过程，大量的细胞堆或大型搅拌罐生物反应器可能只能每次运行产生少量剂量，这在这些疗法的制造中具有严重的瓶颈[6]。因此，迫切需要改善AAV生产的总体过程，以减轻这些治疗的成本负担。一个改进的区域是AAV基因疗法上游生产中的三重转染步骤。
了解AAV载体免疫原性
基因疗法对遗传性单基因疾病，癌症和罕见遗传疾病的患者有希望。天然存在的腺相关病毒（AAV）为临床基因转移提供了合理的载体，因为它缺乏明显的临床致病性和可在多种细胞类型的治疗基因进行长期持续表达的治疗基因的工程性。AAV已被生物工程，以生产许多经批准或晚期发育的基因疗法的重组AAV（RAAV）载体。然而，持续的挑战会更广泛地使用RAAV载体介导的疗法。这些包括对RAAV载体的免疫力，有限的转基因包装能力，亚最佳组织转导，插入诱变的潜在风险和载体脱落。本综述的重点是针对RAAV的免疫力，抗AAV中和抗体（NAB）介导，自然暴露于AAVS或RAAV载体给药后引起。我们对决定AAV血清阳性的因素进行了深入的分析，并检查了管理抗AAV NAB的临床方法。还讨论了用于量化抗AAV NAB水平和克服现有AAV免疫力的策略的方法。广泛采用RAAV媒介介导的基因疗法将需要更广泛的临床欣赏，以减轻其影响。
基于双 AAV CRISPR-Cas9 的“...
mRho hRHO/+ 小鼠注射了双 AAV 系统，其中以不同的载体 1：载体 2 比例识别出领先的 gRNA 59，并在注射后 6 周进行分析（载体 n=12；gRNA 59 n=20–22）。显示平均值 (SD)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 vs 载体。# p<0.05、## p<0.01、#### p<0.0001 vs 其它载体比例。(A) 编辑标准化为转导区域。黑色虚线表示达到治疗相关编辑水平 (≥25%) 的阈值。3 (B) gRNA 水平。(C) Cas9 mRNA 水平。(D) 内源性 hRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的百分比下降。(E) 外源性替代 coRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的倍数增加。AAV，腺相关病毒；bp，碱基对；coRHO，密码子优化的RHO等位基因；gRNA，向导RNA；hRHO，人类RHO等位基因；mRho，小鼠Rho等位基因；NGS，下一代测序；RHO/Rho，视紫红质；SD，标准差。
朝着基于双AAV CRISPR-CAS9的双重前进
MRHO HRHO/+小鼠在各种矢量1：矢量2比率下注射了双AAV系统，并在注射后6周分析了铅GRNA 59，并在注射后6周进行分析（车辆n = 12; n = 20-22的GRNA 59）。平均（SD）。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001与车辆。＃p <0.05，## p <0.01，#### p <0.0001 vs其他向量比。（a）编辑归一化为转导面积的编辑。黑色虚线表示实现治疗相关的编辑水平（≥25％）的阈值。3（b）GRNA水平。（c）Cas9 mRNA水平。（d）内源性HRHO mRNA水平。数据标签表明％降低与车辆。（E）外源替代Corho mRNA水平。数据标签表明折叠与车辆增加。AAV，腺相关病毒； BP，基对； Corho，密码子优化了Rho等位基因； GRNA，导向RNA； Hrho，人类Rho等位基因； Mrho，老鼠Rho等位基因； NGS，下一代测序； Rho/Rho，Rhodopsin； SD，标准偏差。
高效 CRISPR/Cas9/AAV 协议
1. 为了在小鼠 HSPC 中实现有效的同源重组 (HR) 事件，需要具有高编辑效率的特定单向导 RNA (sgRNA)。我们使用 CrispRGold 程序 ( https://crisprgold.mdc-berlin.de ) 来设计特定的 sgRNA 并预测潜在的脱靶 ( Chu et al., 2016a )。每个目标序列应设计几个特定的 sgRNA。必须通过使用 T7 内切酶 I 测定 ( Guschin et al., 2010 ) 测量错配的 DNA 异源双链体以及对至少 2 种主要血细胞类型（例如 B 细胞和 T 细胞）的 PCR 产物进行 Sanger 测序来验证所有 sgRNA 的编辑效率。可以从 IDT、Synthego 或其他供应商处订购化学修饰或未修饰形式的 sgRNA。 2. 供体模板的最佳设计对于小鼠 HSPC 中的高效 HR 至关重要。供体模板包括 5'、3' 同源臂和所需的修饰基因序列。同源臂的长度取决于目标序列的特异性，每个同源臂由 600 到 2000 bp 组成。AAV 基因组的包装能力是设计供体模板的一个限制，因为基于 AAV 的供体模板的最大长度不应超过 4.5kb。如果没有使用报告基因，则应通过引入可用于量化 HR 效率的沉默突变将限制性酶识别位点添加到修饰的基因序列中。3. 为了通过 PCR 扩增和测序量化目标位点中的 HR 和非同源末端连接 (NHEJ) 事件，必须在外部设计正向或反向引物，或两者
AAV生产拟合建模的机器学习
腺相关病毒（AAV）是将基因疗法递送到靶器官的重要车辆。因此，控制其靶向是极大的治疗兴趣。通常，在搜索具有理想的对流的AAV病毒的过程中，筛选了突变的衣壳的大量库。但是，在任何一个实验中筛选的衣壳的数量通常远小于搜索的序列空间。因此，一开始将搜索空间限制为那些会产生可行病毒的衣壳将是有用的。在这里，我们介绍了在此过程中设计为助手的机器学习模型的结果。他们预测了氨基酸序列的生产拟合度，用于在可变区域中的AAV Capsid蛋白VP1中携带插入突变的AAV9病毒8。我们演示了模型的性能，并展示了它们如何用作预筛选工具，以构建具有高平均生产适应性和高度多样性的热带主义筛查的衣壳库。
色谱AAV捕获Sartobind S
腺相关病毒（AAV）是提供基因疗法以治疗各种疾病的领先平台。因此，高级制造过程的需求越来越多，以跟上需求。AAV载体的有效且可扩展的纯化对于临床和商业成功至关重要。sartobind®膜色谱消耗品对于包括AAV矢量在内的大颗粒的纯化尤其有利。由于其主要是固有的对流流，膜与基于树脂的色度图相比，膜具有显着降低的质量转移性。因此，由于低背压轮廓，它们可以以较高的流速进行操作。此外，膜色谱消耗品提供易于处理，简单的就场过程，并且可线性扩展。