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优先利用AAV ITR作为包装终端信号的定量分析
基因工程进步已导致重组腺相关病毒（RAAV）成为开发有效基因疗法的宝贵工具。RAAV的生产容易受到脱靶异质包装的影响，其影响仍在理解。在这里，使用粘附和悬浮液HEK293细胞同时生产具有四基因组长度的RAAV载体，以了解5'ITR终止。AAV8载体是由人FVIII质粒产生的，用于具有特定截断的4,707个核苷酸的全长货物，从而产生较小的基因组。通常，Raav的特征是将空的衣壳与全帽夹区分开，但是对于这项工作，该描述是不完整的。这项研究中的小基因组的特征是电荷检测 - 质谱法（CD-MS）。使用CD-MS，在常规归因于部分的范围内的包装基因组得到解析和定量。此外，碱性凝胶和QPCR用于评估包装基因组的身份。一起，这些结果显示了要封装的单位长度基因组的倾向。包装的基因组是作为从5'ITR发出的复制中间体发生的，表明HEK293细胞更喜欢单位长度基因组，而不是5'ITR终止和先前从SF9 Cell Systems观察到的5'ITR终止和异构DNA包装。由于两种制造过程均已使用并不断评估以生产临床材料，因此这种理解将使RAAV设计用于基础研究和基因治疗。
AAV血清型php.eb与
静止状态功能性MRI（RS-FMRI）在休息期间为大脑功能提供了宝贵的见解，但是由于功能连接性的个体差异，临床应用方面面临挑战。通常使用独立的组件分析（ICA），但它努力与主体间信息平衡单个变化。为了解决这一问题，使用来自多个数据集的模板开发了受约束的ICA（CICA）方法，以提高确定性和可比性。在这项研究中，我们从不同数据集中收集了来自100,517个个体的RS-FMRI数据。数据通过标准fMRI管道进行了预处理。我们的方法首先使用可复制的fMRI组件模板作为约束ICA（神经元管道）中的PRIOR，然后是估计的动态功能网络连接（DFNC）。通过聚类分析，我们生成了可复制的DFNC状态，然后将其用作受限制的ICA中的先验，以自动从新主题中估算特定于主题的状态。这种方法为分析单个RS-FMRI的单个RS-FMRI数据提供了一个强大的框架，同时在大型数据集中保持一致性，同时可以在大型数据集中保持一致性，从而在潜在的临床应用程序中提高RS-fmri的潜在应用。
用于（表观）基因组编辑和基因治疗的 mRNA 反式剪接双 AAV 载体
大基因包括几个 CRISPR-Cas 模块，如基因激活剂 (CRISPRa)，需要双腺相关病毒 (AAV) 载体才能有效地在体内传递和表达。当前的双 AAV 载体方法具有重要的局限性，例如重建效率低、产生外来蛋白质或分裂位点选择的灵活性低。在这里，我们介绍了一种基于通过 mRNA 反式剪接 (REVeRT) 重建的双 AAV 载体技术。REVeRT 在分裂位点选择方面具有灵活性，可以在多种体外模型、人类类器官和体内有效地重建不同的分裂基因。此外，REVeRT 可以通过单一或多重方法在不同的给药途径上功能性地重建针对各种小鼠组织和器官中基因的 CRISPRa 模块。最后，REVeRT 能够在 Stargardt 病小鼠模型中玻璃体内注射后重建全长 ABCA4。由于其灵活性和效率，REVeRT 在基础研究和临床应用方面具有巨大潜力。
评估非人类灵长类动物的新型AAV CAPSID具有广泛的中枢神经系统和外围生物分布
与腺相关病毒（AAV）已成为神经基因治疗的首选递送载体，因为它们的安全性良好，并且在有丝分裂后细胞中转基因表达的寿命。然而，由于自然发生的AAV无法广泛传递人脑，因此基于AAV的基因疗法的临床翻译受到限制。我们在这里报告了一种新型病毒AAV.GMU1的开发，与CNS-Tropic AAVRH10相比，非人类灵长类动物中枢神经系统（CNS）的转基因表达改善。
突破束缚：开发环状 AAV 货物，实现肝脏中的精准无缝整合
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2024 年 10 月 29 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.10.26.620313 doi：bioRxiv preprint
进化的 AAV 变体可实现小鼠 T 细胞的有效基因工程
通信地址：justin.eyquem@ucsf.edu 和 aravind.asokan@duke.edu。 *这些作者的贡献相同 作者贡献 JA、AA、WAN 和 JE 概念化了研究并规划和设计了实验。WAN 和 JA 执行实验、指导研究助理并领导所有实验的后勤和技术方面。JA 领导定向进化和后续数据分析。WAN 领导敲除筛选和敲入策略的设计。An.T. 和 SC 负责实验设计、体外测定数据收集和病毒生产。GR 负责实验设计和体内测定数据收集，An.TAR、JJM 和 JY.C. 负责体外测定数据收集和病毒生产。Al.T、CC 和 VA 负责体外测定数据收集。WHX 负责体外测定数据收集和数据分析。ZS 负责敲除筛选的 NGS 文库设计和测序。LPH 负责实验设计。 HP 与 SK 一起分析了全基因组筛选生成的数据，最后，WAN、JA、AA 和 JE 在 JJM 和合著者的帮助下撰写了手稿。
具有提高AAV生产率的新的T抗原负HEK293细胞系
图1Hekexpress®细胞的基因型表征。（a）使用靶向T抗原编码序列的引物（集1）的引物，跨Hekexpress®基因组的TLA序列覆盖率。绘图表明质粒的积分位点位于3染色体等效物（CHR3）上。（b）使用针对T抗原编码序列（集1）或CHR3（集3和4）的引物（集3和4）的引物（集3和4）的引物，（b）在人类CHR3中整合基因座的TLA序列覆盖率。 集合1的覆盖范围表明，与人类HG38基因组相比，Hekexpress®基因组（绿色箭头）中的550 kb缺失。 集合3和4的覆盖范围确认了综合质量PRTAK的连接。 （c）PRTAK质粒图最初集成在Hekexpress®细胞系中。 大小的T抗原序列在橙色的基因中，在深紫色和grnas（grna_beginning和grna_end）中指示。 （d）Chr3等效（红色）的图与550 kb缺失以及包含T抗原序列的PRTAK质粒的整合。 由TLA证实的质粒 - 染色体连接均以蓝色指示。 Hek，人类胚胎肾； TLA，靶向基因座放大。（b）在人类CHR3中整合基因座的TLA序列覆盖率。集合1的覆盖范围表明，与人类HG38基因组相比，Hekexpress®基因组（绿色箭头）中的550 kb缺失。集合3和4的覆盖范围确认了综合质量PRTAK的连接。（c）PRTAK质粒图最初集成在Hekexpress®细胞系中。大小的T抗原序列在橙色的基因中，在深紫色和grnas（grna_beginning和grna_end）中指示。（d）Chr3等效（红色）的图与550 kb缺失以及包含T抗原序列的PRTAK质粒的整合。由TLA证实的质粒 - 染色体连接均以蓝色指示。Hek，人类胚胎肾； TLA，靶向基因座放大。
mannose耦合的AAV2：第二代AAV载体用于增加视网膜基因疗法效率
遗传性视网膜疾病是失明的主要且无法治疗的原因，因此是基因治疗的候选疾病。重组载体衍生自腺相关病毒（RAAV）是目前最有前途的体内治疗基因传递到视网膜的车辆。然而，在基于RAAV的眼部基因疗法的临床试验中，近期报道强调了基于AAV的新型载体，对眼科应用具有更大的效率对眼科应用。改进的载体的治疗性效果将允许递送的剂量减少，从而减少炎症反应。在这里，我们使用生物结合化学来描述新的RAAV载体的开发，以修改Raav Capsid，从而改善了治疗指数。通过形成硫库键与拉夫capsid的氨基群的共价耦合显着提高了大鼠和非人类灵长类动物的载体转导效率。这些优化的RAAV载体对治疗多种视网膜疾病具有重要的影响。
新生儿AAV基因疗法在SYNE4耳聋
对于各种类型的听力损失，但当前的治疗方案仍主要限于声音放大和人工耳蜗（Muller＆Barr-Gillespie，2015； Schilder等，2018）。SYNE4中的变体（含有核包膜家族成员4）的变体会导致以色列，英国和土耳其个人的常染色体隐性进行性，高调听力损失（Panelapp。; Horn等人，2013年； Masterson等人，2018年）。syne4代码为蛋白质Nesprin-4编码，核骨骼和细胞骨架（LINC）复合物的接头成员（Roux等，2009）。Nesprins位于外部核膜上，它们与内部核膜太阳蛋白相互作用，并与细胞质细胞骨架元素（如肌动蛋白和中间丝）以及运动蛋白以及诸如驱动蛋白（Cartwright＆KarakakeSogoglou，2014年）等运动蛋白。缺乏SYNE4或SUN1的小鼠表现出渐进的听力损失，让人联想到DFNB76；在SYNE4基因敲除小鼠（SYNE4 /）中，毛细胞正常发展，但外毛细胞（OHC）核逐渐失去其基础位置，导致随后的OHC变性（Horn等，2013）。在动物模型中的初步结果确定腺相关病毒（AAV）是聋哑基因治疗的有前途的候选者（Landegger等，2017; Akil等，2019; Isgrig et al，2019; Isgrig et al，2019; Nist-Lund等，2019）。AAV似乎很少引起免疫反应，重组AAVs以非常低的速率整合到宿主中，从而降低了遗传毒性的风险（Nakai等，2001）。天然AAV血清型的初始特征表明内耳细胞类型的转移率相对较低，尤其是OHC（Kilpatrick等，2011）。然而，最近开发的合成AAV Capsids似乎已经克服了这一障碍。已显示AAV9-PHP.B在小鼠和非人类灵长类动物中以高速率转导内毛细胞和外毛细胞（Gyorgy等，2019; Ivanchenko等，2020; Lee等，2020）。在这项研究中，我们将SYNE4 /小鼠用作DFNB76隐性耳聋的模型，以开发基于AAV9-PHP.B的这种形式的人类耳聋的基因治疗作为向量。为转导OHC的形态恢复加上形态恢复，我们观察到了增强的OHC存活，改善了听觉的脑干反应（ABR）以及恢复的失真产物耳声发射（DPOAE）。此外，我们证明了内耳的功能恢复足以驱动
AAV 的候选对象和挑战
缩写：AADC，芳香族 L-氨基酸脱羧酶；AAV，腺相关病毒；ALS，肌萎缩侧索硬化症；APOE，载脂蛋白 E；ASO，反义寡核苷酸；ATXN2，共济失调蛋白 2；BBB，血脑屏障；BSCB，血脊髓屏障；CDKL5，细胞周期蛋白依赖性激酶样 5；CNS，中枢神经系统；CRISPR，成簇的规律间隔的短回文重复序列；CSF，脑脊液；DRPLA，齿状红核苍白球路易体萎缩；FTD，额颞痴呆；FUS，聚焦超声；FXTAS，脆性 X 相关震颤/共济失调综合征；GABA，γ-氨基丁酸；GAD，谷氨酸脱羧酶；GAG，糖胺聚糖； GAN，巨轴突性神经病；GBA，葡萄糖脑苷脂酶；GCH，三磷酸鸟苷环化水解酶；GDNF，胶质细胞源性神经营养因子；ICis，脑池内；ICV，脑室内；IPa，脑实质内；IT，鞘内（腰椎）；IV，静脉内；LacNAc，硫酸化N-乙酰乳糖胺；MAO，单胺氧化酶；miRNA，微小RNA；MLD，异染性脑白质营养不良；MPS，粘多糖贮积症；MRgFUS，磁共振成像引导聚焦超声；MRI，磁共振成像；MSA，多系统萎缩；NCL，神经元蜡样脂褐素沉积症；NGF，神经生长因子；NTN，神经营养素；PDHD，丙酮酸脱氢酶缺乏症；Put，壳核； rAAV，重组腺相关病毒；RNAi，RNA 干扰；siRNA，短干扰 RNA，小干扰 RNA；SMA，脊髓性肌萎缩；SMARD，脊髓性肌萎缩伴呼吸窘迫；SNc，黑质致密部；SOD1，超氧化物歧化酶 1；Str，纹状体；TDP-43，TAR DNA 结合蛋白 43；TERT，端粒酶逆转录酶；TH，酪氨酸羟化酶；Th，丘脑；VTA，腹侧被盖区；ZFN，锌指核酸酶。 * 通讯作者：德克萨斯大学达拉斯分校，800 West Campbell Road, EW31, Richardson, TX 75080, USA。电子邮箱地址：Zhenpeng.Qin@utdallas.edu (Z. Qin)。