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比较 CE-SDS 平台对腺相关病毒 (AAV) 衣壳的纯度和病毒蛋白比率进行定量分析
♦ 毛细管电泳 (CE) 是一种分离技术，利用施加的电压根据离子的电泳迁移率来分离离子。♦ 在毛细管凝胶电泳中，分子通过电流通过聚合物凝胶基质分离♦ 通过凝胶的运动基于分子的大小、形状和电荷♦ 十二烷基硫酸钠 (SDS) 使大多数蛋白质变性，并根据蛋白质的大小以相等的比例结合蛋白质，从而产生均匀的电荷质量比。
AVB-101的临床前发育，AAV基因治疗治疗额颞痴呆症的临时痴呆症
缩写：AAV：腺相关病毒； AAV9：腺相关病毒血清型9;中枢神经系统：中枢神经系统； CSF：脑脊液； ELISA：酶联免疫吸附测定； FB：配方缓冲液； FTD：额颞痴呆； GRN：颗粒蛋白； GRN - / - ：GRN淘汰；下摆：半球； HPGRN：人类PGRN； ITR：反向终端重复； MOI：感染的多样性； N/A：不适用； NFL：神经丝轻链； NHP：非人类灵长类动物； PBS：磷酸盐缓冲盐水； PGRN：pRogranulin; SCMAS：线粒体亚基三磷酸合酶； SD：标准偏差； SMA：脊柱肌肉萎缩； TDP-43：交易反应DNA结合蛋白43; UNTR：未经处理； VA：腹侧前核； VG：矢量基因组； WT：野生型。
使用 DART-AAV 进行体内基因传递，靶向 CD8
体内基因治疗面临的最大挑战之一是载体介导高度选择性的基因转移到特定治疗相关细胞群中。我们在此介绍 DARPin 靶向 AAV（DART-AAV），展示针对人类和鼠 CD8 的 DARPin。将 DARPin 插入 AAV2 和 AAV6 衣壳蛋白 1（VP1）的 GH2/GH3 环中，可实现对 CD8 阳性 T 细胞的高选择性，同时基因传递活性不受影响。值得注意的是，衣壳核心结构未发生改变，突出的 DARPin 可检测到。在复杂的原代细胞混合物中，包括供体血液或小鼠全身注射，CD8 靶向 AAV 在选择性、靶细胞活力和基因转移率方面远远优于未改造的 AAV2 和 AAV6。在体内，将单个载体注射到经过条件化的人源化或免疫功能正常的小鼠中，可击中高达 80% 的活化 CD8+ T 细胞。虽然在非活化条件下基因转移率显著降低，但在将 Cre 递送到指示小鼠中时，仍然可以检测到 CD8+ T 细胞中的选择性基因组修饰。在两种小鼠模型中，CD8+ T 细胞的选择性接近绝对，但肝脏的靶向性极强。本文描述的 CD8-AAV 扩展了免疫学研究和体内基因治疗选择的策略。
共价连接的腺病毒-AAV 复合物作为基因治疗的新型平台技术
Logan Thrasher Collins，1,2 Wandy Beatty，3 Buhle Moyo，4 Michele Alves-Bezerra，5 Ayrea Hurley，5 William Lagor，6 Gang Bao，4 Zhi Hong Lu，2 David T. Curiel 2，* 1 圣路易斯华盛顿大学生物医学工程系；2 圣路易斯华盛顿大学放射肿瘤学系；3 圣路易斯华盛顿大学分子微生物学系；4 莱斯大学生物工程系；5 贝勒医学院分子生理学和生物物理学系；6 贝勒医学院综合生理学系，* 通讯作者。摘要：腺相关病毒 (AAV) 作为基因治疗的递送系统取得了巨大成功，但 AAV 仅有 4.7 kb 的包装容量严重限制了其应用范围。此外，通常需要高剂量的 AAV 来促进治疗效果，从而导致急性毒性问题。虽然已经开发了双重和三重 AAV 方法来缓解包装容量问题，但这些方法需要更高的剂量才能确保以足够的频率发生共感染。为了应对这些挑战，我们在此描述了一种由共价连接到多个腺相关病毒 (AAV) 衣壳的腺病毒 (Ad) 组成的新型递送系统，这是一种以较少的 AAV 总量更有效地共感染细胞的新方法。我们利用 DogTag-DogCatcher (DgT-DgC) 分子胶系统构建我们的 AdAAV，并证明这些混合病毒复合物可实现培养细胞的增强共转导。该技术最终可能会通过提供双重或三重 AAV 的替代方案来扩大 AAV 基因递送的实用性，该替代方案可以在较低剂量下使用，同时达到更高的共转导效率。简介尽管腺相关病毒 (AAV) 基因治疗已显示出巨大的前景并已导致 5 种治疗方法获得临床批准，1–3 但该载体的 DNA 包装能力较低（4.7 kb），一直阻碍着它的应用。人们付出了巨大的努力来开发双重 AAV 系统，该系统将治疗基因的两部分放在不同的衣壳中，旨在共同感染相同的细胞。4–7 类似的三重 AAV 系统也已被探索。8,9 双重和三重 AAV 系统可以通过 DNA 反式剪接、RNA 反式剪接或通过分裂内含肽的蛋白质剪接机制将其分裂的基因重新组合成完整形式。5,7 然而，双重和三重 AAV 通常需要更高的剂量才能实现有效的细胞共转导，尤其是在需要全身给药时。10 这是有道理的，因为两三个货物到达同一个细胞的可能性应该大致分别对应于单个货物到达细胞的比例的平方或立方。因此，大多数双重或三重 AAV 策略都集中于可以局部给药到目标组织的应用，例如视网膜基因治疗。5，7–9 双重和三重 AAV 的另一个缺点是，它们可能导致未接收所有货物的细胞产生部分蛋白质产物。5 由于这些部分蛋白质的翻译量通常比所需的治疗性蛋白质还要大，因此它们可能导致严重的毒性。缓解双重和三重 AAV 基因治疗相关问题的新方法将大大提高 AAV 在治疗需要递送大量转基因序列的疾病方面的适用性。为了应对这些挑战，我们在此构建了一种全新的基因递送系统“AdAAV”，它由更大的（直径约 100 纳米）Ad 衣壳组成，衣壳上装饰有
aAV2.7M8封装包的异质矢量基因组高于AAV2
重组腺相关病毒（RAAV）载体目前是通过基因疗法治疗眼科疾病的唯一经过验证的车辆。目前正在采用针对眼部疾病的广泛基因治疗计划。将近20年的研究已经增强了靶向视网膜组织并改善转基因对特定细胞类型的效率。工程化的AAV CAPSID，AAV2.7M8目前是玻璃体内（IVT）注射后转导视网膜的最佳衣壳之一。然而，在视网膜在临床试验中施用AAV2.7M8载体后，已经报道了包括眼内炎症在内的不良反应。此外，我们一直观察到AAV2.7M8表现出低包装滴度，而与矢量构造设计无关。在本报告中，我们发现AAV2.7M8包装矢量基因组具有比AAV2更高的程度。我们还发现，基因组加载的AAV2.7M8刺激了IVT给药后小鼠视网膜中小胶质细胞的纤维化，而对基因组负载的AAV2和空的AAV2.7M8 capsids的反应产生了很多较轻的响应。这个发现表明，IVT施用AAV2.7M8载体可能会刺激视网膜免疫反应，部分原因是它偏爱包装和提供非单位长度基因组。
使用Qiacuity®DigitalPCR系统
基因组滴度确定高精度。b参考标准标准（后代），并使用CGT DPCR分析在QIACINID DPCR系统上使用2个三个三重反应（ITR，CMVE，CMVP和GFP，WPRE，HGHPA）进行定量。显示了非ITR目标之间的变异系数（CV）。aav2，aAv8和aav9的目标<5％的目标之间的最大偏差<5％，<2％。C基因组完整性使用Qiacuity软件套件2.5版确定。基因组靶标在5个质子反应中运行。进行了基因组完整性的分析，包括所有5个通道或跨越基因组不同部分的2组。
系统性多性状 AAV 衣壳工程实现高效基因传递
扩大基因治疗应用需要可制造的载体，这些载体可以有效地传导人类和临床前模型中的靶细胞。传统的腺相关病毒 (AAV) 衣壳文库选择方法无法在广阔的序列空间中搜索一小部分具有临床转化所必需的多种性状的载体。在这里，我们介绍了 Fit4-Function，这是一种可通用的机器学习 (ML) 方法，用于系统地设计多性状 AAV 衣壳。通过利用均匀采样可制造序列空间的衣壳文库，可以生成可重复的筛选数据来训练准确的序列到功能模型。结合六种模型，我们设计了一个多性状（肝脏靶向、可制造）衣壳文库，并根据所有六个预定标准验证了 88% 的文库变体。此外，仅使用小鼠体内和人类体外 Fit4Function 数据进行训练的模型准确预测了 AAV 衣壳变体在恒河猴中的生物分布。顶级候选物表现出与 AAV9 相当的生产产量、高效的小鼠肝脏转导、高达 1000 倍的人类肝细胞转导以及在恒河猴肝脏转导筛选中相对于 AAV9 的富集度增加。Fit4Function 策略最终使得预测肽修饰 AAV 衣壳的跨物种性状成为可能，并且是组装预测 AAV 衣壳在数十种性状中表现的 ML 图谱的关键一步。
AAV基因治疗50型遗传性痉挛性截瘫
有10,000多种单独的稀有疾病，大多数没有治疗。个性化的基因疗法代表了他们的治疗方法。我们通过建立为遗传性痉挛性截瘫50型（SPG50）的单个患者开发的基因替代疗法，为超稀有疾病提供个性化治疗的路线图。通过多中心合作，创建了基于腺相关的基于腺相关的基于腺相关的病毒基因治疗产物，该基因携带AP4M1基因并在诊断的3年内成功地固定地置于4岁患者，作为单患者1阶段1试验的一部分。主要终点是安全性和耐受性，次要终点评估了功效。给药后12个月，该治疗的耐受性良好。未观察到严重的不良事件，其中包括短暂性中性粒细胞减少症和梭状芽胞杆菌的艰难梭菌胃肠炎，但经历了解决。初步疗效措施表明疾病病程的稳定。需要更长的随访来确认安全性并提供有关治疗功效的更多见解。总体而言，本报告支持SPG50基因疗法的安全性，并为稀有疾病的精确治疗开发提供了见解。临床试验注册：NCT06069687。
通过 AAV 介导递送一种工程化的紧凑型表观遗传编辑器，实现全脑范围内的朊病毒蛋白沉默
结果：为了应对这些挑战，我们设计了一种紧凑的无酶表观遗传编辑器，称为 CHARM（偶联组蛋白尾，用于甲基转移酶的自抑制释放）。通过与组蛋白 H3 尾和非催化性 Dnmt3l 结构域直接融合，CHARM 能够募集和激活细胞内源性表达的 DNA 甲基转移酶，以甲基化靶基因。CHARM 可以独立于 KRAB 转录抑制结构域发挥作用，并与多种 DNA 结合方式兼容，包括 CRISPR-Cas、转录激活因子样效应物和锌指蛋白。锌指蛋白体积小，最多可容纳三个 DNA 靶向元件，并有额外的空间容纳调节元件，以赋予细胞类型特异性。当与靶向锌指结构域的朊病毒蛋白结合并通过 AAV 递送到小鼠大脑时，CHARM 会甲基化朊病毒基因启动子，并使全脑神经元朊病毒蛋白减少高达 80%，远远超过治疗效果所需的最低减少量。此外，我们开发了自我沉默 CHARM，它们在沉默靶标后会自主停用。这种方法暂时限制了 CHARM 表达，以避免因非分裂神经元中的慢性表达而导致的潜在抗原性和脱靶活性。