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成功的CRISPR/CAS介导的基因组编辑取决于在特定的DNA序列下的双链断裂(DSB)的诱导以及随后的错误修复机制的启动。但是,影响CRISPR/CASPR介导的DSB效率和维修保真度的因素在植物中仍未探索。这项研究使用Nicotiana Benthamiana探索DSB修复机制对CAS9和CAS12A酶的编辑效率的影响。测试了基因间(BUR2启动子)和外显子(RDR1)区域中的多个目标位点,以测试在体外和体内编辑中裂解的敏感性。目标部位之间的体内编辑和体外切割效率差异很大。此外,体内编辑效率没有反映体外切割效率。这些结果表明,通过DNA修复机制进行完美的重新连接会损害明显的编辑效率,这表明Indel积累可能无法准确反映CRISPR/CASPR/CAS介导的基因组编辑效率。可以成功设计在DSB修复期间量化和减少完美重新连接的工厂系统。对该系统进行的正在进行的测试表明,不同的CAS酶在DSB修复过程中具有不同级别的完美重新搭配,提供了见解,以进一步优化植物中的编辑策略。
并且肿瘤中超过5个gRNA减少2倍的63个基因座被认为是阳性候选者(图4b,扩展数据图4c和补充表9)。通过Hi-C分析定义拓扑相关域(TAD)(图4c),并选择与每个SE包含在同一TAD中的345个候选靶基因。通过在ASPS-null细胞中下调的表达和功能注释进一步选择了56个候选基因(图4d和补充表10)。对Ccbe1、Pdgfb、Rab27a、Syngr1、Sytl2和Vwf六个候选基因进行了体内验证试验(扩展数据图4d)。验证每个基因有效敲除后(扩展数据图4e),将肿瘤克隆移植到裸鼠体内。尽管体外增殖率相当(扩展数据图 4f),但 Pdgfb、Rab27a、Sytl2 和