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增强器AAV工具箱用于访问和扰动纹状体单元格类型和电路作者Avery C. Hunker 1，＃，Morgan E. Wirthlin 1，＃，Gursajan
增强器AAV工具箱用于访问和扰动纹状体细胞类型和循环作者Avery C. Hunker 1，＃，Morgan E. Wirthlin 1，＃，Gursajan Gill 2，Nelson J. Johansen 1，Marcus Hooper 1，Marcus Hooper 1，Marcus Hooper 1，Marcus hooper 1，Marcus hooper 1，Marcus wivoria Omstead 1，Naz taskin 1，Naz Taskin 1，Natalie Vargquel 2 Gore 1，Yoav Ben-Simon 1，Yeme Bishaw 1，Ximena Opitz-Araya 1，Refugio A. Martinez 1，Sharon Way 1，Bargavi Thyagarajan 1，M。NathalyLerma 1，Will Laird 1，Will Laird 1，Otto Sven 1，Otto Sven 1，Raymond E.A.，Raymond E.A.最佳的课堂载体被策划，用于访问包括中刺神经元（MSN），直接和间接途径MSN以及SST-ChoDL，PVALB-PTHLH和胆碱能中的杂种途径，包括中型棘神经元（MSN），直接和间接途径。特异性通过多种分子验证模式，三种不同的病毒输送途径以及不同的转基因货物评估。重要的是，我们提供详细信息
干细胞研究
SPG11 中的双等位基因致病变异编码了 spatacsin，可导致罕见的运动神经元疾病，如遗传性痉挛性截瘫 11 型 (SPG11-HSP)、夏科-马里-图斯病和青少年型肌萎缩侧索硬化症-5 (ALS5)。SPG11-HSP 是最常见的复杂常染色体隐性 HSP。除了下肢痉挛和截瘫外，SPG11-HSP 患者还存在其他症状，如认知能力下降、上肢无力和周围神经病变（Pozner et al., 2020）。SPG11 编码一种 ~280 kDa 的蛋白质，称为 spatacsin，其参与自噬溶酶体机制的功能和囊泡运输。然而，由于缺乏特异性抗体，spatacsin 的确切功能尚不清楚。为了克服这一障碍，我们生成了一种内源标记的 SPG11 人诱导多能干细胞 (hiPSC) 系 (SPG11-HA)。标记是通过使用 CRISPR/Cas9 技术将具有同源定向修复的 HA 标签插入市售人类游离型 iPSC 系 (A18945；Thermo Fisher Scientific) 中进行的。用编码 SpCas9、GFP 和单个向导 RNA (gRNA；addgene) 的载体以及单链寡核苷酸 (ssODN) 供体 DNA 进行核转染。ssODN 包含一个 HA 编码区，两侧是 ~66 – 67 个核苷酸同源臂（图 1 AB）。经过单细胞分选程序和克隆扩增后，通过 PCR 扩增和桑格测序鉴定出阳性候选者（图 1 A）。通过 Sanger 和 Amplicon/NGS 测序确认了基因型 (图 1 A、C)。在预测的脱靶位点未检测到致病变异 (图 S1 A)。与未经过 CRISPR 过程的 iPSC 对照细胞 (ctrl) 相比，染色体微阵列分析未发现核转染报告系中存在任何从头拷贝数变异 (CNV) (图 1 D)。然而，在这两种细胞系中均发现了 20q11.21 处的增益。这种 CNV 在 hiPSC 和癌症中反复出现，表明它具有增殖或生存优势 (Nguyen et al., 2014)。ctrl 和 SPG11-HA iPSC 均表现出典型的多能性细胞样形态，并经支原体检测呈阴性 (图 S1 BC)。两种细胞系均表达多能性标记，并在三系分化范式测试中分化为所有三个胚层的衍生物（图 1 EF；图 S1 D；表 1）。为了验证报告细胞系的功能，通过蛋白质印迹研究了标记的 spatacsin 的表达。正如预期的那样，HA 标记的 spatacsin 在 280 kDa 的大小下可检测到（图 1 G）。由于 spatacsin 功能丧失后表现出一系列神经系统症状，因此评估了神经分化能力。近 90% 的分化对照和 SPG11-HA 神经祖细胞 (NPC) 表达
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
CRISPR-CAS9如何逐步工作
CRISPR-CAS9是编辑基因和基因组的强大工具。它使用引导的RNA在特定位置切割DNA，从而使研究人员可以操纵各种生物的基因组，包括动物，植物和微生物。基因编辑曾经被认为是科幻小说，但现在是现实。CRISPR-CAS9具有多种应用，包括创建遗传学的生物，治疗遗传疾病以及发展经济上重要的植物物种。有不同的方法来编辑基因，包括从生物体的基因组中插入，去除或删除序列。CRISPR-CAS9是为此目的最受欢迎的工具之一。它易于使用，高度准确且精确。该系统由核酸序列（CRISPR）和酶（CAS9）组成。需要一个引导的RNA（SGRNA）来促进目标特异性操作。CRISPR-CAS9系统于1987年首次由Ishino及其同事在1987年解释。在本文中，我们将使用简单的语言逐步解释该过程，以便初学者可以彻底理解它。我们不会从事科学写作，而要专注于外行术语的每个步骤。使用CRISPR-CAS9进行基因编辑的步骤是：1。选择实验2。选择目标基因位置3。选择并设计CRISPR-CAS9系统4。合成并克隆sgrna 5。交付sgrna和cas9 6。验证实验7。培养和分析替代细胞8。但是，其应用程序已扩展到各个字段。研究基因表达CRISPR系统首先用于研究基因敲除，其中从模型生物体中除去基因或DNA序列。通过遵循这些步骤，研究人员可以在实验室中执行基因编辑和基因工程。CRISPR-CAS9基因编辑：逐步指南我们将通过计算分析给定的基因，收集有关其序列，GC含量，表型和其他突变的数据。此信息将帮助我们设计带有指导的RNA来通过定位PAM序列来编辑基因。要选择一个用于沉默或去除的区域，我们必须选择适合我们实验要求的CRISPR-CAS9系统。提供不同的CAS蛋白，例如基因基因敲除，序列DCAS9的变化：激活和抑制以及其他诸如CAS13，Cas12，CSM，CMR和RNase III之类的其他。我们需要根据我们的需求选择正确的CAS9和CRISPR序列。CAS蛋白是一种可裂解单链和双链DNA的核酸酶。一个短的RNA序列（称为SGRNA或GRNA）可以通过靶向特定位置来编辑基因。sgrna有两个部分：具有互补的20个核苷酸的crRNA和识别Cas9的tracrocrrna环。一旦Tracrrna识别Cas，它就会将细胞核引导到裂口位置。，我们必须考虑到PAM序列的位置来计算设计SGRNA。一旦设计了GRNA，我们就需要将其合成并克隆质粒。我们的最先进的设施使我们能够在体外合成GRNA或SGRNA的寡聚。体外转录也有助于合成SGRNA。然后，我们选择一个特定的质粒，将GRNA基因插入其中，开发克隆，并分离从质粒表达的GRNA。现在我们的GRNA已合成，我们可以使用电穿孔方法将CAS9和SGRNA插入目标细胞中。我们还可以使用特定于CAS或病毒载体的mRNA，例如腺病毒，腺相关病毒，慢病毒和逆转录病毒。总体而言，CRISPR-CAS9基因编辑需要仔细的计划和执行。通过遵循这些步骤，我们可以使用这种强大的技术成功操纵基因。现在我们的CAS和SGRNA就在目标单元内，是时候验证敲除是否准确地发生了。用于验证的三种常见技术是聚合酶链反应（PCR），体外转录或DNA测序。DNA测序是在实验之前和之后进行的，使我们能够比较结果并确定是否已成功去除基因。PCR通过扩增从修饰细胞的目标序列来验证实验。此外，我们可以执行限制消化实验来验证结果。我们现在有了转基因细胞系，需要使用适当的培养基在无菌条件下培养它。一旦获得了足够量的细胞系，我们就可以将它们插入目标生物。注意：这是对CRISPR-CAS9机制的简化解释。Cas9核酸酶活性产生的差距不能保持未填充；取而代之的是，诸如非同源末端连接或直接DNA修复之类的DNA修复机制填补了空白。但是，我们的故事并没有结束。我们必须执行多个实验以检查改变的细胞的状态。基因表达研究是一种选择，我们在其中使用RT-PCR或定量PCR检查了所有细胞系改变基因的表达。可以在计算和物理上分析结果。计算工具有助于分析基因序列，表达谱等。体格检查有助于了解是否诱导了新的表型，是否仍然存在原始表型，或者结果不正确。此简短概述概述了在遗传实验室中进行CRISPR-CAS9实验的标准过程。但是，结果的特异性取决于我们选择的系统。如果我们选择了错误的CAS9，我们将无法实现所需的结果。SGRNA的设计也至关重要，因为如果不仔细设计，它可能会裂开未靶向区域。如果您有兴趣了解有关CRISPR-CAS9系统的更多信息，请从Addgene：CRISPR中阅读本文。与我们的新闻通讯一起呆在循环中，并包含最新的博客文章，发人深省的文章和重要的更新。另外，要第一个了解新产品和SNAG独家优惠！