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针对DNA / RNA和Amplicon样品的样品制备和运输的指南< / div>
• Double-stranded high molecular weight DNA with an OD 260/280 ≥ 1.8-2,0 and an OD 260/230 ≥ 1,8-2,2 • Preferably dissolved in RNAse-, DNAse- and protease-free Tris-HCl buffer (pH 8.0 – 8.5) • “Ready to load” genomic libraries, ready to load PCR products or PCR products without sequencing adapters must be column purified从低分子量的杂质（例如底漆和核苷酸）和反应缓冲液中，应在琼脂糖凝胶上以单条带的形式出现。请注意，除了特定频段之外，“涂片”将干扰以下准备步骤。在咨询时，欧罗芬基因组学可以执行额外的珠子纯化步骤（以额外的费用），以便在进行进一步处理之前优化样品质量。•该溶液不得包含任何杂质，例如生物学大分子（例如蛋白质，多糖，脂质），螯合剂（例如EDTA），硫代金属阳离子（例如，MG2+），脱位剂（例如，变性）（例如Triton-X100）。
错误、嵌合体、偏差和 GC 含量对扩增子测序准确性的影响
摘要 靶向扩增子测序广泛应用于微生物生态学研究。然而，测序伪影和扩增偏差令人担忧。为了确定这些伪影的来源，我们使用由来自 33 种细菌菌株的 16S rRNA 基因组成的模拟群落进行了系统分析。我们的结果表明，虽然测序错误通常只发生在低丰度操作分类单元中，但嵌合序列是伪影的主要来源。单序列和双序列主要是嵌合体。嵌合序列的形成与目标序列的 GC 含量显着相关。低 GC 含量的模拟群落成员表现出较低的嵌合序列形成率。GC 含量对序列恢复也有很大影响。定量能力明显有限，恢复率差异很大，预期和观察到的菌株丰度之间的相关性较弱。GC 含量较高的模拟群落菌株的恢复率高于 GC 含量较低的菌株。由于引物亲和力的差异，还观察到了扩增偏差。两步 PCR 策略将嵌合序列的数量减少了一半。此外，基于模拟群落的比较分析表明，几种广泛使用的序列处理流程/方法，包括DADA2、Deblur、UCLUST、UNOISE和UPARSE，在伪影去除和稀有物种检测方面各有优缺点。这些结果对于提高测序质量和可靠性以及开发新的算法来处理目标扩增子序列具有重要意义。
靶向扩增子深度测序用于监测肯尼亚西部的抗疟药耐药性标志物
摘要 恶性疟原虫的分子监测对于追踪新出现的突变和已发现突变的趋势非常重要，应作为抗疟药耐药性的早期预警系统。2019 年，在肯尼亚西部八个县对学童进行了恶性疟原虫疟疾调查，从调查中获取了干血斑。实时 PCR 鉴定出 500 个恶性疟原虫阳性样本，这些样本在五个耐药位点进行了扩增，以进行靶向扩增子深度测序 (TADS)。重要的 kelch 13 突变的缺失与 2019 年前肯尼亚的发现相似，在密码子 569 和 578 中观察到低频突变。氯喹抗性转运蛋白基因密码子 76 和 145 为野生型，表明寄生虫分别对氯喹和哌喹敏感。基于密码子 86、184 和 199 的多药耐药基因 1 单倍型主要存在于单倍型 NYT 和 NFT 的混合感染中，分别由缺乏氯喹压力和使用苯芴醇驱动。磺胺多辛-乙胺嘧啶耐药性谱是 Pfdhfr（51I 59R 108N）和 Pfdhps（436H 437G 540E）三重突变的“超级耐药”组合，导致磺胺多辛-乙胺嘧啶无效。TADS 突出显示了低频变异，从而可以尽早识别新的突变、Pfmdr1 密码子 199S 和 Pfdhfr 密码子 85I 以及新出现的 164L 突变。TADS 的附加价值在于它能够准确地识别混合基因型感染并进行抗疟药耐药性标志物的高通量监测。
使用...
摘要：现代生物学，尤其是合成生物学，在很大程度上依赖于DNA元素的结构，通常是以质粒的形式进行的。质粒用于多种应用，包括用于随后纯化的蛋白质的表达，用于生产有价值化合物的异源途径的表达以及对生物学功能和机制的研究。对于所有应用，构建质粒后的关键步骤是其序列验证。传统的序列确定方法是Sanger测序，每反应限制约为1000 bp。在这里，我们提出了一种高度可扩展的内部方法，用于使用长阅读纳米孔测序快速验证放大的DNA序列。我们开发了两步扩展和转座酶策略，为双条形码测序提供了最大的灵活性。我们还提供了一个自动分析管道，以快速可靠地分析测序结果，并为每个样本提供易于解释的结果。用户友好的duba.Flow开始到虚拟管道广泛适用。此外，我们表明，使用duba.Flow的构造验证可以通过条形码菌落PCR扩增子测序进行，从而加速了研究。关键字：合成生物学，长阅读测序，DNA构造验证，菌落PCR，实验室自动化，双条形码扩增子测序■简介
基于纳米孔的RSV整个基因组测序
（棕色），只有G基因（深红色）和缺失的G和F基因测序（也称为深绿色的“其他”），分别由DNA纯化（紫色）救出。在基因组位置（蓝色）和（红色）PCR扩增子清理的基因组位置的测序代表性RSV-A（E）和RSV-B（f）的覆盖深度。bar图显示了NGS的折叠变化读取的映射到未经PCR扩增子纯化的未经和带有PCR扩增的放大器的测序样品和高（g）和高（H）浓度的RSV参考基因组。将洗涤的PCR扩增子的库的 ngs读取为标准化，并表示为对未洗的PCR扩增子的折叠更改，该折叠设置为1。。 数据表示为平均值±SD。 进行 t检验分析的统计显着性。 p值小于0.05被认为具有统计学意义，并将其标记为 *。ngs读取为标准化，并表示为对未洗的PCR扩增子的折叠更改，该折叠设置为1。数据表示为平均值±SD。t检验分析的统计显着性。p值小于0.05被认为具有统计学意义，并将其标记为 *。
针对恶性疟原虫多样性和抗性的灵敏和模块化扩增子测序，用于研究和公共卫生
。CC-BY-NC 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2024 年 8 月 25 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.08.22.609145 doi：bioRxiv 预印本
开发了纳米孔测序策略，用于检测突变，在金黄色葡萄球菌菌株中赋予万古霉素中间耐药性
摘要金黄色葡萄球菌是菌血症和其他医院感染的主要原因。细胞壁活性抗生素万古霉素通常用于治疗耐甲氧西林（MRSA）和敏感（MSSA）感染。万古霉素中间的金黄色葡萄球菌（Visa）变体可以通过从头突变产生。在这里，我们进行了试点实验，以开发一种基于PCR/长阅读测序的合并的方法，用于检测先前已知的签证突变。引物旨在生成10个含量涵盖与签证表型相关的16个基因。我们对牛津纳米孔衔接子的读数长期读取，我们对据和and go骨流通量进行了测序。然后，我们通过映射读取读取的父母共识或已知参考序列，并比较称为变体与实验室选择中已知签证突变的数据库进行了比较。池中的每个扩增子被测序为高（。1,000）覆盖范围，并且在扩增子长度和覆盖范围之间未发现任何关系。我们还能够检测到因果突变（步行646c。g）在源自USA300菌株的签证突变体中（来自父母菌株N384的N384-3）。将突变体（N384-3）和父母（N384）DNA从0到1个突变体以不同的比例（N384）DNA表明平均次要等位基因频率（6.5％）的突变检测阈值在95％侧置（两个标准的差异高于平均突变频率高于平均值的频率））。该研究奠定了直接的金黄色葡萄球菌抗生素抗生素基因型基因型推断，并使用临床样品的快速纳米孔测序。
使用牛津纳米孔扩增子测序的温室灌溉水中真菌和卵菌病原体的早期评估
水传播植物的致病真菌和卵菌是温室生产系统中的主要威胁。对这些病原体的早期检测和量化将使我们能够及时治疗所需的经济和生物阈值，从而改善有效的疾病管理。在这里，我们使用了牛津纳米孢子的扩增子来分析从用于生长番茄，黄瓜和Aeschynanthus sp的温室收集的灌溉水中的微生物群落。真菌和卵形群落的特征是使用放大整体内部转录垫片（ITS）区域的引物。为了评估小兵测序的灵敏度，我们将串行稀释的模拟DNA刺激到图书馆制备之前从温室水样品中分离的DNA中。真菌和卵骨读数的相对丰盛在温室灌溉水中和来自番茄番茄的设置中的水样中与众不同。在相应的连续稀释样品中衍生出的源自真菌和卵形模拟群落的序列读数是成比例的，因此确认了最小值扩增子测序对环境监测的适用性。通过使用尖峰标准来测试使用小兵测试定量的可靠性，我们发现样品中尖峰ins的检测受到了真菌或卵形DNA的背景量的高度影响。我们观察到，与较长的尖峰（> 790bp）相比，我们大多数稀释液的长度较短（538bp）的尖峰在我们的大部分稀释液中产生。此外，相对于稀释序列，序列读数不均匀，并且在具有最高DNA浓度的背景样品中最不可检索，这表明性能的动态范围狭窄。我们建议对小兵测序进行连续的基准测试，以改善未来快速植物性诊断和监测的定量元编码工作。
高通量快速扩增子测序，用于来自存档的临床DNA样品的支原体卵巢卵的多焦点序列
遗传多样性的宿主范围（1，3）。 卵巢支原体的遗传多样性含量很高，表明它们是重要的储层和感染来源的作用，而在BHS中，它很低，表明溢出物是主要的传输来源（1）。 的确，来自多层次序列分型（MLST）序列对祖先序列的状态重建证实了家用绵羊作为BHS的主要感染来源，强调了菌株键入对映射传输动力学的重要性（4）。 在BHS中，最初发生致命支气管瘤的爆发通常是在羔羊中反复发生的致命爆发。 在初始溢出后的2到15年观察到了反复爆发（2，5 - 7）。 最近的证据表明，可能没有跨支架免疫，使存活的动物容易感染（4，8）。 为了减少溢出事件的可能性，联邦和州机构实施了针对国内和野羊的空间分离的政策（9）。 最近在美国西部和加拿大进行了增加的采样工作，以发现10个州和三个省份的Ovipneumoniae大分枝杆菌的流行率（10）。遗传多样性的宿主范围（1，3）。卵巢支原体的遗传多样性含量很高，表明它们是重要的储层和感染来源的作用，而在BHS中，它很低，表明溢出物是主要的传输来源（1）。的确，来自多层次序列分型（MLST）序列对祖先序列的状态重建证实了家用绵羊作为BHS的主要感染来源，强调了菌株键入对映射传输动力学的重要性（4）。在BHS中，最初发生致命支气管瘤的爆发通常是在羔羊中反复发生的致命爆发。在初始溢出后的2到15年观察到了反复爆发（2，5 - 7）。最近的证据表明，可能没有跨支架免疫，使存活的动物容易感染（4，8）。为了减少溢出事件的可能性，联邦和州机构实施了针对国内和野羊的空间分离的政策（9）。最近在美国西部和加拿大进行了增加的采样工作，以发现10个州和三个省份的Ovipneumoniae大分枝杆菌的流行率（10）。