Agencourt® Ampure® Beads(Beckman Coulter)制备 - NEBNext 快速 DNA 样本制备主混合物套装,用于 454 端修复和 dA 尾(E6090)
agencourt®Ampure®珠(Beckman Coulter)制剂-Nebnext快速DNA样品准备主混合组合454端修理和DA -Tailing(E6090)
步骤:洗脱单面大小选定的片段。如何:指示操作员将PCR板从位置C转移到B。然后将40 µL分子级水从位置A(图2,粉红色)上的DWP的D列转移到B位置B上的PCR板的每个孔(图2,黄色)。混合15次确保对磁珠的正确重息,然后进行5分钟的RT孵育以进行洗脱。然后,Voyager将提示操作员将PCR板放回位置C的磁铁板上(图4),并将新的96井PCR放在位置B上。延迟3分钟后,用环磁铁捕获磁珠(图5),Voyager将35 µL的浮出水面带到位置B上的新PCR板上,在C位置C中在板中保留5 µL,以防止磁珠下listrover。在运行结束时,告诉用户从位置B中存储PCR板,然后从磁盘上取下板。
posiCharge™系统是一个隔离的产品线。ampure和Ampure徽标是Ampure的商标。公司名称,商标,注册商标,服务标记,符号和徽标本文所述的财产是其各自公司的财产。规格如有更改,恕不另行通知。POW ER循环和测试系统的图像是代表性的;生产模型可能会有所不同。未经Ampure事先书面许可,可以重复,使用或披露这些材料的任何部分。
使用sanger of Life of Life HMW DNA碎片剪切的DNA:DIAGENODEMEGAUPTOR®3用于PACBIO HIFI协议,使用0.6倍Ampure PB珠与DNA体积的比例。对于使用生命的Sanger树剪切的DNA HMW DNA碎片:DIAGENODEMEGAUPTOR®3用于LI PACBIO协议,使用1倍Ampure Pb珠与DNA体积的比例。对于使用生命的Sanger树剪切的DNA HMW DNA碎片:用于ULI PACBIO协议的G-Tube,使用0.6倍AMPURE PB珠与DNA体积的比例。为了允许执行QC并满足Sanger进行测序的内部需求,在步骤13中添加了49 µL的EB(3 µl为QC,45.4 µL用于测序),但是可以使用任何数量的EB缓冲液来洗脱剪切的DNA。
mgieasy DNA清洁珠用于纯化和DNA样品的尺寸选择。我们优化的缓冲液系统恢复了100 bp以上的DNA产物。mgieasy DNA清洁珠与各种品牌的DNA和RNA库构造套件兼容。它们的使用方式与Ampure XP珠完全相同。纯化产率和碎片尺寸分布与Ampure XP珠的分布一致。mgieasy DNA清洁珠可以代替Ampure XP珠。
注意:此处提供的Spriselect或Nebnext样品纯化珠的体积可与此步骤中的精确缓冲液中包含的样品一起使用(71.5 µL;步骤1.2.5。)。也可以使用Ampure XP珠。如果使用Ampure XP珠,请在使用前至少30分钟将珠子温暖至室温。这些珠子量可能无法正常工作以在工作流程的不同步骤中进行清理,或者在此步骤中是第二个清理。对于在不同缓冲条件下包含的样品的清理,可能需要实验确定体积。
生物学资格结果通过准备NGS库来评估hamilton ngs Star V上的Qiagen QiaSeq FX DNA方法的性能,并使用QIASEQ FX FX DNA库套件具有重复性,以下是不同的样品Buffer EB。进行了三种生物运行;两个使用大肠杆菌gDNA(DH10B)和QIASEQ珠或Agencourt Ampure XP珠(包括1个阴性对照)和一个使用Microbial社区组成ATCC MSA-1003(20个菌株),ATTC MSA-1001(10菌株)和E. Coli Gdna(dhsec)和QH10B(DH10B)(包括12个菌株)(包括12个菌株)和QASE(dhsseq)(QIACE)(QIACE),使用了八个样品,其中有八个样品和QIASEQ珠子或QIASEQ珠子或Agencourt Ampure XP珠(包括1个阴性对照)。在运行期间施加了10分钟的碎片时间和七个PCR周期。用于文库制备的生物学资格,用定量1x DSDNA HS分析套件确定最终文库浓度。随后,八样本运行的所有库的库大小分布,
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建(350-450bp 插入大小):将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂,使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人(Beckman-Coulter,美国)上准备的。简单来说,DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化(每60uL DNA 40-45uL 珠子),在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化,然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理,并用Klenow片段(3'到5'外显子减去)进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后,进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物,然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组,用 Phusion DNA 聚合酶(美国赛默飞世尔科技公司)进行 PCR 扩增,循环条件为:98˚C 30 秒,然后 6 个循环,98˚C 15 秒,62˚C 30 秒,72˚C 30 秒,最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物,并使用高灵敏度分析(美国珀金埃尔默公司)用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化(在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖),并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计(Invitrogen)评估和量化 DNA 质量,然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前,通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序:使用 1-5 mg Qubit(Life Technologies,加利福尼亚州卡尔斯巴德)定量基因组 DNA 进行文库构建,如所述(Gascard 等人,2015 年)。为了追踪亚硫酸盐转化的效率,将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中,并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小,并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA,并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾;这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端,然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后,将胞嘧啶甲基化双端接头(5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5')在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟,并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前,用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段,并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒(Zymo Research)按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环
在使用Tethers帮助将DNA端子运输到毛孔的情况下,创建了奴才库,因此无法创建库后的尺寸选择(由于电泳是由于电泳而去除的)。因此,在创建库之前必须执行尺寸选择。另一方面,在创建库或多次执行的AMPURE XP纯化的干燥步骤时,DNA在移液器期间略有碎片,因此,即使执行了尺寸选择,也会在序列数据中读取短DNA,但是如果未执行尺寸选择,则较短读取的比例也会增加。客户评论