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通过计算设计的聚合物纳米颗粒（PNP）递送质粒DNA
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2025年2月23日发布。 https://doi.org/10.1101/2025.02.22.639634 doi：Biorxiv Preprint
使用 RNP 在永生化细胞系中进行阵列式 CRISPR 多向导文库核转染
功能测定通常使用阵列式 CRISPR 筛选进行，以关联每种基因扰动对细胞功能、形态或生理学方面的影响。优化所选测定至关重要，以确保其能够可靠地识别感兴趣的表型。这可以使用测定特异性阳性和阴性对照来完成（参见第 5 页的建议对照表）。此外，优化 CRISPR 编辑和测定之间的时间也很重要，以确保可以测量清晰的表型信号。测定特异性阳性对照可用于此目的。
Arryed Crispr grna库
感谢您为您的实验选择Arrayed Crispr Grna库！Editco的人类和小鼠筛选库利用多指导SGRNA的策略性设计来消除您感兴趣的人类或小鼠蛋白质编码基因。SGRNA在靶向基因组基因座处共同引起片段缺失，因此破坏了基因功能并使其非常适合丧失功能筛选。Editco库的阵列格式，其中一个基因在多井板上的每个孔都被靶向，从而消除了对复杂数据反卷积的需求，并且与各种功能测定兼容。此快速启动指南提供了有关如何准备，使用，存储和量化SGRNA库的说明。
用于人类基因组的强大且多功能的阵列文库...
图 1. APPEAL 克隆。A、从载体 pYJA5 中去除氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)。sgRNA1-4 和甲氧苄啶抗性基因 (TmpR) 与三个不同的 PCR 扩增子融合。所有元件均经过 Gibson 组装以形成 4sgRNA-pYJA5 质粒，并用甲氧苄啶筛选转化子。描绘了 4sgRNA-pYJA5 全质粒和 4sgRNA 盒的详细结构。LTR，长末端重复；Ψ，包装信号序列；PB，piggyBac 转座子元件；PuroR，嘌呤霉素抗性元件；hU6、mU6、hH1 和 h7SK 是普遍表达的 RNA 聚合酶 III 启动子；sg，sgRNA。 B、转化大肠杆菌并进行甲氧苄啶筛选后，代表性 pYJA5 限制性片段、3 片段 PCR 和 APPEAL 克隆产物的单菌落 PCR。Bbs I 消化 pYJA5 产生约 1 千碱基 (kb) 的 AmpR 元件条带和约 7.6 kb 的线性化载体条带（左）。使用相应的 sgRNA 引物进行 PCR 后，三个扩增子在琼脂糖凝胶上分别显示预期的 761、360 和 422 bp 大小（中）。使用转化细菌平板中 APPEAL 克隆产物 4sgRNA 盒两侧的引物进行单菌落 PCR 始终产生预期大小（2.2 kb，右）。 C ，8 个具有不同 4sgRNA 序列的独立 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比（每个实验测试 ≥22 个菌落）。D ，四个 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比。每个点代表一个由八个菌落组成的独立生物复制品（n=24；平均值 ± SEM）。E ，高通量格式的 APPEAL 克隆时间线（h：小时；d：天）。
单个微生物的阵列无标记培养和生长评估
图 S1. 皮升级孵化器阵列的制作方案。孵化器图案由 2D CAD 软件（DraftSight，法国 Dassault Systèmes SE）设计。孵化器的设计直径为 30 µm。首先将光刻胶（ZPN 1150-90，日本 Zeon 公司）以 2500 rpm 的转速旋涂在玻璃基板上 30 秒。然后，使用标准光刻工艺对光刻胶膜进行图案化。光刻胶膜的图案化残留物（高度约为 10 µm 的微柱）被用作孵化器阵列的模板。接下来，采用旋涂技术（旋转速度：4000 rpm）将氟惰性溶剂（CT-solv.180，AGC Inc.，日本）中的非晶态氟聚合物（Cytop CTX-809SP2，AGC Inc.，日本）沉积在模板上。之后，在涂有氟聚合物的基板上沉积 PDMS 薄膜。薄膜结构有助于抑制基板因内部应力而表现出的自弯曲现象。这意味着通过采用薄膜结构可以保持 PDMS 培养箱阵列和玻璃皿之间的界面粘附力。在这方面，我们采用旋涂沉积工艺来制备基于 PDMS 的培养箱阵列。将含有固化剂的 PDMS（Sylgard 184，陶氏化学公司，美国）的低聚物溶液旋涂在模板上并固化。 PDMS 膜的最终厚度约为 20 µm。然后，将完成的 PDMS 膜从模板上剥离。使用 LEXT OLS4100 激光扫描显微镜（日本奥林巴斯）确认 PDMS 膜的图案。
仿生空间三维阵列多焦点超透镜的理论设计
摘要：随着微纳光学的发展，超表面作为新型电磁波控制器件受到越来越多的关注，其中超透镜由于其独特的光学性质，作为超表面的典型应用得到了开发和应用。然而，以前的大多数超透镜只能产生一个焦点，严重限制了它们的应用。受苍蝇复眼的启发，我们提出了一种特殊的空间多焦点超透镜。我们的超透镜可以反转入射圆偏振光的偏振态，然后将其聚焦。此外，通过设计合理的相位和区域分布，可以实现水平排列的多焦点超透镜，这与垂直排列的多焦点超透镜类似。最重要的是，通过结合这两种分布方法，可以很好地实现具有低串扰的空间三维阵列多焦点超透镜。所提出的仿生三维阵列多焦点超透镜具有惊人的聚焦效果，有望在成像、纳米粒子操控、光通信等领域得到应用。