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RNA 引导的 AsCas12a 和 SpCas9 催化敲除...
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2021 年 11 月 23 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.11.15.468743 doi：bioRxiv preprint
化学修饰的 AsCas12a 向导 RNA 可改善不同组织中脂质纳米颗粒介导的体内基因编辑
（Cytiva）。LNP 货物是编码工程 AsCas12a 核酸酶和 gRNA 的 mRNA，重量比为 1:1。通过 RiboGreen 测定法（ThermoFisher Scientific）评估 LNP 的包封率大于 80%，多分散性指数 (PDI) <0.2，通过 Zetasizer 分析（Malvern Panalytical，型号 ZSU3205）评估平均直径大小 <105 nm。• 细胞培养处理：用指定浓度的包封 AsCas12a mRNA 的 LNP 处理细胞，并在转染后 72 小时分离 gDNA。原代人肝细胞 (PHH) 的转染包括重组人载脂蛋白 E。进行基于扩增子的下一代测序 (NGS) 以确定编辑百分比。 • 小鼠眼内体内编辑：通过前房内注射将 LNP 递送至每只 hMYOC Y437H（具有 Y437H 突变的人类肌动蛋白基因）敲入小鼠的一只眼中。注射后一周，解剖眼球，从前房分离 mRNA。采用基于转录本的 RT-ddPCR 检测来测量剩余 hMYOC mRNA 的程度。 • 小鼠肝脏内体内编辑：通过尾静脉静脉注射将 LNP 递送至 hMYOC Y437H 小鼠。注射后一周，解剖肝脏，分离 gDNA，并进行基于扩增子的 NGS 以确定编辑百分比。 • 体外结合亲和力测量：将标记的未修饰的向导与重组工程 AsCas12a 和浓度不断增加的修饰“测试”向导混合，在室温下孵育 3 小时，然后在硝酸纤维素印迹膜 (Cytiva) 和 Hybond N+ 膜 (Cytiva) 上进行双重过滤分离。在每个膜上定量荧光标记的未修饰向导，并计算结合的未修饰向导的百分比。标记的未修饰向导的结合百分比降低是由于来自修饰的“测试”向导的结合竞争。
Reni-Cel，一种研究的ASCAS12A基因编辑的细胞药
*可在八名患者中评估的植入。†ANC≥0.5×10 9 /L的三个连续测量。基于八名在数据截止日期之前获得中性粒细胞植入的患者。‡连续三个连续测量，血小板计数≥20×10 9 /L，至少在血小板输血后7天开始，在血栓蛋白后10天。基于八名患者在数据截止日期之前获得血小板植入的患者。ANC，绝对中性粒细胞计数； Reni-Cel，Renizgamglogene AutogedTemcel； SD，标准偏差。
标题：RENI-CEL，首个 ASCAS12A 基因编辑细胞疗法，在输血依赖性 BE 的关键临床结果中显示出有希望的初步结果
第 3 个月，全细胞分布（n=6）。在输注 reni-cel 后 0.5 – 2.2 个月接受最后一次红细胞输注后，所有 7 名患者在 1.2 – 9.9 个月内均不再需要输血。reni-cel 的安全性与白消安的骨髓清除性预处理一致。输注 reni-cel 后，没有
改造 Cas12a 核酸酶变体，增强基因组编辑特异性
AU：请确认所有标题级别均正确显示：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas12a 系统是基因编辑的强大工具；然而，crRNA-DNA 错配可能会引起不必要的切割事件，尤其是在 PAM 的远端。为了最大限度地减少这种限制，我们通过修改与靶 DNA 和 crRNA 链相互作用的氨基酸残基，设计了一种携带突变 S186A/R301A/T315A/Q1014A/K414A 的超保真 AsCas12a 变体（称为 HyperFi-As）。HyperFi-As 保留了与人类细胞中的野生型 AsCas12a (AsCas12aWT) 相当的靶向活性。我们证明 HyperFi-As 显著降低了人类细胞中的脱靶效应，并且与野生型相比，HyperFi-As 对 PAM 远端区域位置的错配容忍度明显较低。此外，采用改进的适当恒定力单分子 DNA 解拉链分析来评估 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 复合物的稳定性和瞬态阶段。在 DNA-Cas12a-crRNA 复合物的解体过程中敏感地检测到了多种状态。在脱靶 DNA 底物上，与 AsCas12aWT 相比，HyperFi-As-crRNA 更难维持 R 环复合物状态，这可以准确解释为什么 HyperFi-As 在人类细胞中具有较低的脱靶效应。我们的研究结果提供了一种具有低脱靶效应的新型 AsCas12a 变体，尤其能够处理 PAM 远端区域的高脱靶。在单分子水平上，我们还揭示了 AsCas12a 变体在脱靶位点的行为方式，而用于评估 CRISPR/Cas RNP 复合物多种状态的解压缩分析可能对深入了解 CRISPR/Cas 的行为方式以及将来如何对其进行工程改造大有帮助。
EDIT-202，一种多路复用 CRISPR-Cas12a 基因......
• 使用 SLEEK ™ 方法，用工程化的 AsCas12a 编辑 iPSC，敲入 CD16 和 mbIL-15。3 同时，还用 AsCas12a 编辑 iPSC，敲除 CISH 和 TGFβR2。然后将 iPSC 克隆分化为 iNK 细胞。流式细胞术证明 DKI iNK 细胞表面表达 CD16 和 mbIL-15。• 使用 Incucyte ® 成像 NucLight Red 标记的 SK-OV-3 细胞进行 3D 肿瘤球体杀伤试验，以评估 iNK 细胞的细胞毒性。通过在基础培养基中培养野生型 (WT) 和 DKI iNK 细胞 21 天（不含支持细胞因子）来测量体外持久性。 • 非肥胖糖尿病 (NOD) 严重联合免疫缺陷 (scid) γ (NSG) 小鼠接种 0.25x 10 6 荧光素酶 (luc) 表达 SKOV-3 细胞系 (SKOV-3-luc) 卵巢肿瘤细胞。小鼠接受单次腹膜内 (IP) 剂量 500 万 WT iNK 或 EDIT-202 细胞，多次 IP 剂量 2.5 mg/kg 曲妥珠单抗 (TRA)。使用 Perkin Elmer 生物发光体内成像系统 (IVIS) 计算肿瘤负荷。披露
Cas12a 直系同源物和工程变体的高通量分析，以增强基因组编辑活性
摘要：CRISPR/Cas12a（以前称为 Cpf1）是一种 RNA 引导的 VA 类 CRISPR 系统内切酶，为基因组工程提供了一种有前途的工具。目前已鉴定出 10 多个 Cas12a 直系同源物，并用于人类细胞的基因编辑。然而，新兴 Cas12a 直系同源物之间的功能多样性仍未得到充分探索。本文，我们通过构建包含 40,000 多个引导 RNA 的基因组整合、自切割、配对 crRNA 靶标文库，报告了 16 个 Cas12a 直系同源物在人类细胞中的编辑活性的高通量比较分析。三种 Cas12a 候选物由于其结构紧凑且编辑效率与 AsCas12a 和 LbCas12a 相当而表现出良好的潜力，而 AsCas12a 和 LbCas12a 的特征已得到充分表征。我们通过结构引导的蛋白质工程生成了三种精氨酸替代变体 (3Rv)：BsCas12a-3Rv (K155R/N512R/K518R)、PrCas12a-3Rv (E162R/N519R/K525R) 和 Mb3Cas12a-3Rv (D180R/N581R/K587R)。与野生型 Cas12a 效应子相比，这三种 Cas12a 变体均表现出增强的编辑活性和扩大的靶向范围 (NTTV、NTCV 和 TRTV)。三种 Cas12a 变体之间的碱基偏好分析表明，PrCas12a-3Rv 在具有典型 PAM TTTV 和非典型 PAM TTCV 的靶位点上表现出最高活性，而 Mb3Cas12a-3Rv 表现出与其他变体不同的识别特征，在 PAM TATV 的 -3 位置和 PAM ATCV 的 -4 位置容纳更多的核苷酸 A。因此，扩展的 Cas12a 工具箱和对 Cas12a 活动的更好理解应该有助于它们在基因组工程中的应用。
针对功能基因组学的工程化 CRISPR-Cas12a 的高阶组合染色质扰动
多重遗传扰动对于测试编码或非编码遗传元件之间的功能相互作用至关重要。与 DNA 切割相比，使用 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 抑制染色质形成可避免基因毒性，并且在混合检测中更有效地扰乱非编码调控元件。然而，目前的 CRISPRi 混合筛选方法通常仅限于每个细胞靶向 1-3 个基因组位点。为了开发一种在功能基因组学筛选中使用 CRISPRi 对基因组位点进行高阶 (> 3) 组合靶向的工具，我们设计了一种 Acidaminococcus Cas12a 变体——称为多重转录干扰 AsCas12a (multiAsCas12a)。 multiAsCas12a 在使用慢病毒转导传递的 CRISPR RNA（crRNA）高阶多路复用阵列进行组合 CRISPRi 靶向时，其表现明显优于最先进的 Cas12a 变体，
一种用于体内基因组编辑的新型紧凑型 Cas12a 变体
为了使通过腺相关病毒 (AAV) 载体进行的基因治疗取得成功，载体基因组大小是一个主要制约因素，因为它会阻止将较大的转基因包装到二十面体病毒衣壳中。在基于 CRISPR 的基因组编辑背景下，已经描述了多种紧凑型 Cas 变体，例如 Cas12j (CasPhi) 或 Cas12f (CasMINI) [ 1 , 2 ]，它们可用于通过 AAV 递送进行体内基因组编辑。在 Wang 等人的研究中 [ 3 ]，一种来自丹毒菌 (EbCas12a) 的新型紧凑型 Cas12a 变体被表征为当通过点突变 (enEbCas12a) 改进时，显示出与其他 Cas12a 变体相似的编辑效率 [ 3 ]。值得注意的是，EbCas12a 的编码序列比下一个更大的已表征 Cas12a 变体小约 150 bp（图 1），有利于将其容纳在“一体化” AAV 载体中，该载体在单个 AAV 模板上提供 Cas12a 和 crRNA。通过使用单一载体给药，作者证明了新型 AAV-enEbCas12a 载体介导体内基因组编辑的能力，从而为不断扩展的 CRISPR 工具箱增加了一个新条目。首先，作者通过体外切割试验表征了 EbCas12a，并确定 TTTV（V = G、C 或 A）为 PAM 序列，这与其他已报道的 Cas12a 系统类似。接下来，EbCas12 被证明在培养的哺乳动物细胞中具有功能性，这通过两个报告基因和各种基因组位点的切割得到证实。然而，与其他 Cas12a 变体（例如常用的 AsCas12a 和 LbCas12a）相比，EbCas12a 效率较低。因此，为了放宽 PAM 序列限制并提高 AsCas12a 的编辑效率，作者们在 EbCas12a 中替换了一个氨基酸，以建立 PAM 近端 DNA 接触，从而产生了变体 enEbCas12a。事实上，这种单点突变将基因组位点的编辑效率提高了约 2 倍。然而，与此同时，放宽 PAM 序列限制可能会增加 enEbCas12a 脱靶编辑的风险。为了通过实验检验这一担忧，对脱靶编辑事件进行了全基因组分析。值得注意的是，检测到的脱靶位点数量为
一种高度特异性的 CRISPR-Cas12j 核酸酶能够使等位基因
CRISPR-Cas 系统可通过非同源末端连接 (NHEJ) 基因破坏突变等位基因来治疗常染色体显性遗传病。然而，目前的 CRISPR-Cas 系统无法将许多单核苷酸突变与野生型等位基因区分开来。在这里，我们对六种 Cas12j 核酸酶进行了功能性筛选，并确定 Cas12j-8 是一种具有超紧凑尺寸的理想基因组编辑器。Cas12j-8 表现出与 AsCas12a 和 Un1Cas12f1 相当的活性。Cas12j-8 是一种高度特异性的核酸酶，对原间隔区相邻基序 (PAM) - 近端区域中的单核苷酸错配敏感。我们通过实验证明 Cas12j-8 能够对具有单核苷酸多态性 (SNP) 的基因进行等位基因特异性破坏。Cas12j-8 识别简单的 TTN PAM，可提供高靶位点密度。计算机模拟分析显示，Cas12j-8 能够对 ClinVar 数据库中的 25,931 个临床相关变异和 dbSNP 数据库中的 485,130,147 个 SNP 进行等位基因特异性破坏。因此，Cas12j-8 特别适合用于治疗应用。