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Bxb1 的定向进化用于模块化整合酶 (MINT) 的开发
Sebastian Arangundy Franklin、Friedrich Fauser、Luis Rodriguez、Nicola J Schmidt、Nicholas A Scarlott、Adeline Chen、Rakshaa Mureli、Bhakti N Kadam、Jessica E Davis、Lifeng Liu、Danny F Xia、Mohammad Qasim、Taleoh J Bryange Vaidyak、Lam、Andrew Nguyen、David Paschon、Gregory Davis 和 Jeffrey C Miller
介绍DNA识别螺旋工程改变...
• 通过结构建模、定向进化和人类细胞筛选相结合的方法，我们重新编程了丝氨酸整合酶 Bxb1 的特异性。然后，我们利用这些重新编程的 Bxb1 变体，将千碱基大小的构建体精确整合到人类基因组内的多个内源位置，具有高活性和有希望的全基因组特异性。DNA 识别螺旋工程改变 Bxb1 特异性
哺乳动物基因组中结构变体的多重生成和单细胞分析
结果：在此概念证明中，我们将基因组剃须 - seq应用于小鼠胚胎干细胞和人类癌细胞，每实验产生并绘制数百至数千个SV。我们发现，通过CRE介导的对称LOXP位点产生SVS的细胞是迅速决定的，这可能是由于CRE和/或SVS本身的毒性所致。相比之下，在非对称attb/p位点，通过BXB1介导的重组产生SV的细胞是稳定的。这种稳定性使我们能够研究作用于不同类别BXB1诱导的SV的选择压力，并开始表征其功能后果。首先，我们发现带有较大缺失但没有反转的细胞是从增殖的细胞种群中预先损失的，这部分归因于不容忍中心粒损失。第二，我们观察到，尽管平衡的易位在体外耐受，不平衡的易位，尤其是那些敏感的易位，但迅速耗尽了。最后，通过在基因组洗牌细胞的瓶颈种群中共同合并转录组和盒式盒式条形码配对，我们证明我们可以确保特异性，诱导的SVS对基因表达的后果。
系统地发现重组酶，以便将大型 DNA 序列有效整合到人类基因组中
大型丝氨酸重组酶 (LSR) 是一种 DNA 整合酶，可促进移动遗传元件在细菌基因组中的位点特异性整合。迄今为止，只有少数 LSR（如 Bxb1 和 PhiC31）被鉴定，作为人类细胞中 DNA 整合的工具，其效率有限。在这项研究中，我们开发了一种计算方法来识别数千个 LSR 及其 DNA 附着位点，将已知的 LSR 多样性扩大了 100 倍以上，并能够预测它们的插入位点特异性。我们在人类细胞中测试了它们的重组活性，将它们归类为着陆垫、基因组靶向或多靶向 LSR。总体而言，我们实现了比 Bxb1 高出七倍的重组率，基因组整合效率为 40-75%，货物大小超过 7 kb。我们还展示了无病毒的质粒或扩增子文库的直接整合，以改进功能基因组学应用。这种直接从微生物测序数据中系统地发现重组酶的做法，提供了超过 60 种在人体细胞中经过实验表征的 LSR 资源，可用于大负载基因组插入，且不会暴露 DNA 双链断裂。
大规模发现用于将 DNA 整合到人类基因组中的重组酶
最近的微生物基因组测序工作揭示了大量含有整合酶的移动遗传元件，这些整合酶可能成为有用的基因组工程工具。大型丝氨酸重组酶 (LSR)，例如 Bxb1 和 PhiC31，是噬菌体编码的整合酶，可以促进噬菌体 DNA 插入细菌基因组。然而，之前仅鉴定了少数 LSR，它们在人类细胞中的效率有限。在这里，我们开发了一个系统的计算发现工作流程，通过识别数千个新的 LSR 及其同源 DNA 附着位点。我们通过在人类细胞中对 LSR 进行实验表征来验证这种方法，从而产生了三类根据其效率和特异性彼此区分的 LSR。我们识别了可有效整合到与人类基因组正交的合成安装附着位点的着陆垫 LSR、具有计算可预测伪位点的人类基因组靶向 LSR，以及可以单向整合货物的多靶向 LSR，其效率与常用转座酶相似，特异性更高。每个类别的 LSR 在人类细胞中都进行了功能鉴定，总体而言，其质粒重组率比 Bxb1 高出 7 倍，基因组插入效率为 40-70%，载物大小超过 7 kb。总体而言，我们建立了一个范例，用于大规模发现微生物重组酶并直接从微生物测序数据重建其靶位。该策略提供了丰富的资源，包括 60 多种经过实验鉴定的 LSR，这些 LSR 可以在人类细胞中发挥作用，以及数千种额外的候选 LSR，可用于大负载基因组编辑，而不会暴露 DNA 双链断裂。
一步标记：一种快速站点的多功能方法......
2 开放目标，英国剑桥 Wellcome 基因组园区 摘要 DNA 序列位点特异性整合到基因组中是基础研究、合成生物学和细胞治疗应用的重要工具。它可用于蛋白质标记以研究表达、定位和相互作用，以及在内源性调控元件下或在一致的安全港基因座下表达转基因。在这里，我们开发并优化了一种简单有效的位点特异性整合方法，该方法结合了使用单链寡核苷酸模板的 CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复与位点特异性重组酶 Bxb1，以允许大型货物整合到基因组的任何位置。我们的技术需要现成的 Cas9 和寡核苷酸试剂以及一组适用于任何整合位点的货物质粒。我们通过在多个位点和多种细胞类型（包括诱导多能干细胞和原代 T 细胞）中进行标记来证明该方法的适应性。我们表明，我们的方法可以整合大型（最多 14 kb）货物，并且可以同时标记两个基因或通过结合整合和 Cas9 介导的敲除或其他 HDR 事件来编辑两个位点。