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双重靶向CRISPR-CASRX在体外和体内降低了C9orf72 ALS/FTD感官和反义重复RNA
额颞痴呆（FTD）和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的最常见遗传原因是G 4 C 2重复扩展在C9orf72基因的内含子中。这种重复的扩展经历了双向转录，产生了感觉和反义重复的RNA物种。在所有阅读帧中，有义务和反义的重复RNA都经历重复相关的非AUG翻译，以生成五种不同的二肽重复蛋白（DPRS）。重要的是，毒性与感官和反义重复衍生的RNA和DPR既相关。这表明针对感官和反义重复RNA可能会提供最有效的治疗策略。涉及RNA的CRISPR-CAS13系统为同时定位多个RNA转录本的途径提供了有希望的途径，因为它们成熟了自己的引导阵列，因此可以从单个构造中靶向一个以上的RNA物种。我们表明，源自Ruminococcus flavefaciens（CASRX）的CRISPR-CAS13D可以成功地将C9orf72 sense和反义重复记录和DPR降低到过度表达C9orf72重复的HEK细胞中的背景水平。CRISPR-CASRX还显着降低了三种独立的C9ORF72患者衍生的IPSC-神经元系中的内源性和反义重复RNA和DPR，而没有可检测到的脱靶效应。为了确定CRISPR-CASRX在体内是否有效，我们使用AAV递送处理了两种不同的C9orf72重复小鼠模型，并观察到在有意义和反义重复的转录本上都显着降低。这项工作共同介绍了将RNA靶向CRISPR系统作为C9ORF72 ALS/FTD的治疗方法的潜力。
C9orf72 六核苷酸重复扩增在 ALS 中的作用/...
肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和额颞叶痴呆 (FTD) 是具有共同的神经退行性途径和特征的进行性神经系统疾病。ALS/FTD 最常见的遗传原因是 9 号染色体开放阅读框 72 (C9orf72) 基因第一个内含子区域的 GGGGCC 六核苷酸重复扩增。在这篇综述中，我们全面总结了阐明 ALS/FTD 中六核苷酸重复扩增相关致病机制的越来越多的证据。这些机制包括 DNA 和转录 RNA 的结构多态性、通过相分离形成的 RNA 焦点以及二肽重复蛋白的细胞质积累和毒性。此外，G-四链体结构的形成严重损害了 C9orf72 蛋白的表达和正常功能。我们还讨论了 GGGGCC RNA 对特定 RNA 结合蛋白的隔离，这进一步加剧了 C9orf72 六核苷酸重复扩增的毒性。对 ALS/FTD 中六核苷酸重复扩增致病机制的深入了解为这些毁灭性疾病提供了多种潜在的药物靶点。
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C9ORF72中内含子GGGGCC的重复膨胀是肌萎缩性侧面硬化症和额颞痴呆的常见遗传原因。重复序列均以意义和反义方向转录，以产生不同的二肽重复蛋白，其中poly（ga），poly（gr）和pr pr（pr）与神经变性有关。poly（pr）与RNA结合可能有助于毒性，但是尚未对转录组对poly（pr）-RNA结合的分析进行分析。因此，我们在人类细胞中进行了交联和免疫沉淀（夹）分析，以识别py（PR）的RNA结合位点。我们发现poly（PR）与近600个RNA结合，序列Gaaga富含结合位点。体外实验表明，聚（Gaaga）RNA与对照RNA高的（PR）结合pol（PR），并诱导聚（PR）的相分离为冷凝物。这些数据表明poly（PR）优先结合含Poly（Gaaga）的RNA，这可能具有生理后果。
层次谱聚类揭示了 C9orf72 无症状携带者的大脑大小和形状变化
用于检测神经退行性疾病（例如阿尔茨海默病或额颞叶变性）中无症状脑部变化的传统方法通常是在预定义的粒度级别上评估体积变化，例如逐体素或先验定义的感兴趣皮质体积。在这里，我们应用一种基于层次谱聚类的方法，这是一种基于图的分区技术。我们的方法使用多级分割，在标准统计框架内以数据驱动、无偏见、全面的方式检测变化。此外，谱聚类可以检测形状变化和大小变化。我们使用层次谱聚类进行了基于张量的形态测量，以检测遗传性额颞叶痴呆症倡议无症状和有症状的额颞叶变性突变携带者的变化，并将结果与更传统的基于体素张量和体素的形态测量分析的结果进行了比较。在有症状组中，基于层次谱聚类的方法产生的结果与基于体素的方法获得的结果大致一致。在无症状的 C9orf72 扩增携带者中，谱聚类检测到了内侧颞叶皮质的大小变化，而基于体素的方法只能在症状期检测到。此外，在无症状和有症状期，谱聚类方法检测到了 C9orf72 的运动前皮质形状的变化。总之，本研究显示了层次谱聚类在数据驱动的分割和检测单基因额颞叶变性的有症状和无症状阶段的结构变化方面的优点。
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内含子GGGGCC（G 4 C 2）在人C 9 ORF 72基因内的六核苷酸重复膨胀是家族性肌营养性侧面硬化症（ALS）和额叶临时痴呆（FTD）（FTD）的最常见原因（C 9 Als/FTD）。重复相关的非aug（RAN）翻译反复含量C 9 ORF 72 RNA导致神经毒性二肽重复蛋白（DPRS）的产生。在这里，我们开发了一个高通量药物筛选，用于鉴定DPR水平的正和负调节剂。我们发现HSP 90抑制剂Geldanamycin和醛固酮拮抗剂螺内乳酮通过分别通过蛋白酶体和自噬途径促进蛋白质降解，从而降低了DPR水平。令人惊讶的是，营地升高化合物增强蛋白激酶A（PKA）活性提高了DPR水平。 通过药理学和遗传方法抑制PKA活性，在C 9 ALS/FTD的果蝇模型中，细胞中的DPR水平降低并挽救了病理表型。 此外，敲低DPR的PKA催化亚基与降低的翻译效率相关，而PKA抑制剂H 89降低了C 9 ALS/FTD患者衍生的IPSC运动神经元的内源性DPR水平。 一起，我们的结果表明，在C 9 ALS/FTD中调节DPR水平的新途径。令人惊讶的是，营地升高化合物增强蛋白激酶A（PKA）活性提高了DPR水平。通过药理学和遗传方法抑制PKA活性，在C 9 ALS/FTD的果蝇模型中，细胞中的DPR水平降低并挽救了病理表型。此外，敲低DPR的PKA催化亚基与降低的翻译效率相关，而PKA抑制剂H 89降低了C 9 ALS/FTD患者衍生的IPSC运动神经元的内源性DPR水平。一起，我们的结果表明，在C 9 ALS/FTD中调节DPR水平的新途径。