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cas12a目标歧视
此预印本的版权持有人（该版本发布于2023年5月16日。; https：//doi.org/10.1101/2023.05.16.541046 doi：biorxiv Preprint
Lb Cas12a 核酸酶
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Cas12a 针对多重基因组的优化
图 1. 现有 Cas12a CRISPRa 技术的评估。A) 采用两种不同的 Cas12a 核酸酶失活突变的 CRISPRa 构建体的比较。通过转导五天后表达 CD4 的细胞百分比来测量激活程度。B) 针对采用直接与 dCas12a (D908A) 连接的 TAD 组合的 12 种 CRISPRa 构建体变体，以基线表达为标准对 CD4 平均荧光强度 (MFI)。C) 示意图描绘了基于流式细胞术的平铺筛选的概览，该筛选用于识别其他活性 Cas12a CRISPRa 指南。D) 根据指南靶位点相对于 CD4、CD26、CD97 和 CD274 的转录起始位点 (TSS) 的位置绘制了每个指南在技术重复中的绝对最小 LFC 的 Z 分数。
Cas12a 在解脂耶氏酵母中起指导作用
摘要 全基因组功能性遗传筛选已成功发现基因型-表型关系并设计新表型。虽然广泛应用于哺乳动物细胞系和大肠杆菌，但在非常规微生物中的使用受到限制，部分原因是无法准确设计此类物种的高活性 CRISPR 向导。在这里，我们开发了一种针对所选生物体（在本例中为产油酵母解脂耶氏酵母）的 sgRNA 设计实验计算方法。在不存在非同源末端连接（主要的 DNA 修复机制）的情况下进行负选择筛选，用于生成 SpCas9 和 LbCas12a 的单个向导 RNA (sgRNA) 活性谱。这种全基因组数据作为深度学习算法 DeepGuide 的输入，该算法能够准确预测向导活性。 DeepGuide 使用无监督学习来获取基因组的压缩表示，然后通过监督学习来映射具有指导活性的 sgRNA 序列、基因组背景和表观遗传特征。全基因组和选定基因子集的实验验证证实了 DeepGuide 能够准确预测高活性 sgRNA。DeepGuide 提供了一种生物体特异性的 CRISPR 指导活性预测因子，可广泛应用于真菌物种、原核生物和其他非常规生物。
Cas12a 的体外应用
Bender MA。引自：Adam MP、Ardinger HH、Pagon RA、Wallace SE、Bean LJH、Stephens K 和 Amemiya A 编辑。Gene Reviews® [Internet]。西雅图 (WA)：华盛顿大学，西雅图；1993-2018 年。
Cas12a 使用嵌合 DNA-RNA 向导
CRISPR-Cas9 系统广泛用于靶向基因组工程。Cpf1 是 CRISPR 效应子之一，通过识别富含胸腺嘧啶的原间隔区相邻基序 (PAM) 序列来控制靶基因。Cpf1 对向导 RNA 中的错配的敏感性高于 Cas9；因此，脱靶序列识别和切割较低。但是，它可以容忍原间隔区中远离 PAM 序列 (TTTN 或 TTN) 的区域中的错配，并且当 Cpf1 活性因治疗目的而得到改善时，脱靶切割问题可能会变得更加成问题。在我们的研究中，我们研究了 Cpf1 的脱靶切割，并修改了 Cpf1 (cr)RNA 以解决脱靶切割问题。我们开发了一种 CRISPR-Cpf1，它可以通过用 DNA 部分替换 (cr)RNA 来改变碱基配对的能量势，从而以高度特异性和有效的方式诱导靶 DNA 序列中的突变。提出了一个模型来解释嵌合 (cr)RNA 引导的 CRISPR-Cpf1 和 SpCas9 切口酶如何在细胞内基因组中有效发挥作用。在我们的结果中，当使用嵌合 DNA-RNA 引导进行基因组编辑时，CRISPR-Cpf1 在细胞水平上诱导的脱靶突变较少。这项研究有可能用于治疗无法治愈的癌症
Cas12a CRISPR 混合 RNA-DNA (chRDNA)
1 克利夫兰诊所 2019，淀粉样变性研究联盟，2024 2 Ruberg，FL 等人。《美国心脏病学会杂志》，73(22)，2872–2891
CRISPR/CAS12A基因组编辑工具箱...
甲烷古细菌在全球碳循环中起着重要作用，可以作为CO 2和其他一碳基质的燃料和化学物质生物技术生产的宿主生物。甲藻菌的乙酰硫酸酯因其较大的基因组，多功能底物范围和可用的遗传工具而被广泛研究为甲烷原模型。也已经证明了通过CRISPR/CAS9在M. acetivorans中进行基因组编辑。在这里，我们描述了一个用户友好的CRISPR/CAS12A工具箱，该工具箱识别富含T的PAM序列。该工具箱可以管理3,500 bp（即淘汰整个Frhadgb操纵子）和异源基因插入的缺失，正率超过80％。cas12a介导的多重基因组编辑用于在一轮编辑中编辑染色体上的两个单独的位点。达到了100 bp的双重删除，正确编辑了8/8的转化子。在一个位置同时删除100 bp，并用2,400 bp的UIDA表达盒在另一个位置替换100 bp，可在单独的位置上获得5/6个正确编辑的转换物。我们的CRISPR/CAS12A工具箱可实现可靠的基因组编辑，并且可以与先前报道的基于CAS9的基于CAS9的系统并行使用，用于甲状腺素物种的基因工程。
CRISPR-Cas9/Cas12a 生物技术及其在细菌中的应用
CRISPR-Cas 技术极大地改变了生物学领域。在这篇综述中，我们讨论了 CRISPR-Cas，特别关注了研究和使用最广泛的 CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 的相关技术和应用。我们讨论了 CRISPR-Cas 作为免疫防御系统的生物学机制、最近发现的抗 CRISPR-Cas 系统以及具有独特特征的新兴 Cas 变体（如 xCas9 和 Cas13）。然后，我们重点介绍了各种 CRISPR-Cas 生物技术，包括核酸酶依赖性基因组编辑、CRISPR 基因调控（包括 CRISPR 干扰/激活）、DNA/RNA 碱基编辑和核酸检测。最后，我们总结了生物技术在各种细菌物种的合成生物学和代谢工程中的最新应用。
CAS12A应用在细菌中的最新进展
抽象聚类定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）介导的基因组工程和相关技术在过去十年中彻底改变了生物技术，通过提高了复杂的生物系统的效率。cas12a（CPF1）是与许多原核生物中发现的CRISPR自适应免疫系统相关的RNA引导的内切酶。与其更突出的对应物Cas9相反，Cas12a识别富含DNA序列，并能够直接处理其相应的指南RNA，从而使其成为多重基因组编辑工作和其他应用于生物技术中的多功能工具。虽然CAS12A已在真核细胞系统中广泛使用，但微生物应用仍然受到限制。在这篇综述中，我们强调了Cas12a和Cas9之间的机械和功能差异，并着重于使用CAS12A在细菌宿主中使用CAS12A的最新应用。此外，我们讨论了优势以及当前的挑战，并为这种有希望的替代CRISPR-CAS系统提供了未来的前景，用于细菌基因组编辑及其他挑战。