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CRISPR-CAS12A基因组在整个植物水平上使用两个兼容的RNA病毒载体
摘要使用可以在宿主植物中复制并系统地移动的病毒载体以传递细菌CRISPR组件，从而可以在整个植物水平上进行基因组编辑，并避免对劳动力密集型稳定转化的要求。但是，这种方法通常依赖于先前转化的植物，这些植物稳定地表达了CRISPR-CAS核酸酶。在这里，我们描述了使用烟草eTCH病毒（TEV； PotyVirus属）和马铃薯病毒X（PVX; PVX;属Potexvirus）得出的两个兼容的RNA病毒载体的成功无DNA的基因组编辑，这些病毒是在同一细胞中复制的。TEV和PVX载体分别表达CAS12A核酸酶和相应的指导RNA。这种新型的两场媒介系统改善了植物中无病毒诱导的基因组编辑的工具箱，并将促进繁殖更多营养，耐药性和生产性作物的努力。
科学期刊
CRISPR-Cas12a 已被用作操纵靶基因表达的有力工具。以更精确的时空分辨率和深层组织通透性操纵 CRISPR-Cas12a 活性的可能性将使靶向基因组工程成为可能，并加深我们对复杂细胞行为背后的基因功能的理解。然而，目前可用的可诱导 CRISPR-Cas12a 系统受到扩散、细胞毒性和组织通透性差的限制。在这里，我们开发了一种远红光 (FRL) 诱导的 CRISPR-Cas12a (FICA) 系统，该系统可以在哺乳动物细胞中强有力地诱导基因编辑，以及一种基于蛋白质标记系统 SUperNova (SunTag) 的 FRL 诱导的 CRISPR-dCas12a (FIdCA) 系统，可用于在基于发光二极管的 FRL 下激活基因。此外，我们表明 FIdCA 系统可用于激活小鼠肝脏中的靶基因。这些结果表明，此处开发的系统为以非侵入性和时空方式进行可编程基因组操作提供了强大而高效的平台。
微型 VF 型 CRISPR-Cas 核酸酶可实现细胞中的靶向 DNA 修饰
2 类 CRISPR 系统极其多样化，但所有系统都共享一个效应蛋白，该蛋白包含保守的 RuvC 样核酸酶结构域。有趣的是，这些 CRISPR 相关 (Cas) 核酸酶的大小范围从 Cas9/Cas12a 的 >1000 个氨基酸 (aa) 到 Cas12f 的 400-600 个 aa。对于体内基因组编辑应用，紧凑的 RNA 引导核酸酶是理想的，并且可以简化细胞递送方法。尽管微型 Cas12f 效应子已被证明可以切割双链 DNA，但真核细胞中的靶向 DNA 修饰尚未得到证实。在这里，我们从生物化学角度表征了两种微型 VF Cas 核酸酶，SpCas12f1 (497 aa) 和 AsCas12f1 (422 aa)，并表明 SpCas12f1 在植物和人类细胞中均能发挥作用，产生针对性的修饰，在植物中，短热脉冲可增强修饰效果。我们的发现为开发基于微型 Cas12f1 的基因组编辑工具铺平了道路。
遗传学 利用 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在哺乳动物细胞和小鼠中产生精确的大片段缺失
目前，Cas9 和 Cas12a 系统被广泛用于基因组编辑，但它们精确产生大片段染色体缺失的能力有限。I-E 型 CRISPR 介导广泛和单向的 DNA 降解，但迄今为止，控制 Cas3 介导的 DNA 缺失的大小已被证明是难以捉摸的。在这里，我们证明了 Cas9 的内切酶失活 (dCas9) 可以精确控制哺乳动物细胞中 Cas3 介导的大片段缺失。此外，我们分别报告了使用 CRISPR/Cas3 和 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在小鼠中消除 Y 染色体和精确保留 Sry 基因。总之，dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 介导的精确大片段缺失为通过染色体消除建立动物模型提供了一种方法。该方法也有望成为治疗涉及额外染色体的片段突变或人类非整倍体疾病的潜在治疗策略。
超紧凑型 CRISPR-Cas12j2 (CasΦ) 可实现植物的基因组编辑、基因激活和表观基因组编辑
CRISPR-Cas9、-Cas12a、-Cas12b 和 -Cas13 已被用于人类和植物细胞的基因组工程（Liu et al., 2022）。然而，这些 Cas 蛋白的尺寸较大（例如 SpCas9 为 190 kDa），难以通过病毒载体递送到细胞中。开发更小的 Cas 蛋白将导致病毒载体尺寸减小，从而可以在多功能基因组工程系统中更广泛地采用。最近，在巨型噬菌体中发现了 CRISPR-Cas12j2 (Cas F) 系统，由于 Cas12j2 的尺寸较小（80 kDa），该系统发展成为超紧凑基因组编辑器（Pausch et al., 2020）。不幸的是，使用核糖核蛋白传递的拟南芥原生质体中 Cas12j2 的基因编辑效率不到百分之一（Pausch 等人，2020 年）。如果植物科学界要采用 CRISPR-Cas12j2 介导的植物基因组编辑，显然需要进一步优化该系统。
在糖尿病患者的葡萄糖预测背景下的语法指导遗传编程中的表征进行比较
最近开发的CRISPR激活剂（CRISPRA）系统使用基于CRISPR-CAS效应子的转录激活剂有效地控制靶基因的表达而不会引起DNA损伤。但是，基于CAS9/CAS12A的现有CRISPRA系统必须在效力和准确性方面提高，这是由于与CRISPR-CAS模块本身相关的限制。为了克服这些局限性，并有效，准确地调节基因表达，我们基于小的CRISPR-CAS效应子candidatus woesearchaeota cas12f（CWCAS12F）开发了一个有效的CRISPRA系统。通过设计CRISPR-CAS模块，链接激活域，并使用接头和核定位信号序列的各种组合，优化的ECWCAS12F-VPR系统启用了与使用现有CRISPRA系统相比，基因表达的有效和目标特定于基因表达的调节。这项研究中开发的ECWCAS12F-VPR系统具有控制生物体内源基因转录的巨大潜力，并为未来的基因疗法和生物学研究提供了基础。
热诱导 CRISPR/Cas12b (C2c1) 的应用......
摘要 CRISPR/Cas9 和 Cas12a (Cpf1) 工具已大规模用于基因组编辑。最近建立了一种具有单个核酸酶结构域、相对较小尺寸、低频率脱靶效应和高温下切割能力的新效应物，并将其命名为 CRISPR/Cas12b (C2c1)。Cas12b 还表现出在哺乳动物系统中的温度诱导性。因此，该系统对于编辑耐高温植物物种（如棉花）的基因组具有潜在价值。利用这种新系统，在一系列温度下通过农杆菌介导的遗传转化成功生成了陆地棉突变体。暴露在 45°C 下 4 天的转化子（被农杆菌感染的外植体）显示出最高的编辑效率。全基因组测序未检测到脱靶突变。T0 代中 AacCas12b 进行的基因组编辑忠实地传递给了 T1 代。综上所述，CRISPR/Cas12b 是一种高效、精确的棉花基因组编辑工具。
GB4.0平台，CRISPR/CAS ...
CRISPR/CAS能够同时瞄准多个基因座（多重）的能力是改变植物育种的游戏规则。多路复用不仅会加速性格金字塔，而且还可以揭示功能冗余所隐藏的特征。此外，多路复用增强了基于DCAS的可编程基因表达，并实现了类似级联的基因调节。然而，包含串联阵列导向RNA（GRNA）的多重构建体的设计和组装需要无疤的克隆，并且由于存在重复序列而仍然很麻烦，从而阻碍了更广泛的使用。在这里，我们介绍了软件辅助克隆平台Goldenbraid（GB）的全面扩展，其中除了其多基因克隆软件之外，我们将新的工具集成了新的工具，用于基于IIS的易于且六个串联阵容的GRNA，使用Cas9和cas12a，使用GRNA-trees-trees-trees-crrna-crrrna-crrrna和crrrnna crrrnna crrrnna crrrnna crrrna carrna-crrrna crrrna cas12a。作为新工具的应力测试，我们组装并用于农杆菌介导的稳定转化A 17 cas9-grnas构造，靶向烟草中的Squamosa-promoter结合蛋白样（SPL）基因家族的子集。14个选定的基因是miR156的靶标，因此在少年到成年和营养至生殖相变中可能起重要作用。使用17个grnas构建体，我们生成了一组无Cas9的SPL编辑的T 1植物，该植物携带了多达9个双重突变，并显示出叶少年和更多的分支。GB4.0 Genome Edition纳入了新的基于Web的工具和随附的DNA零件集合，为植物基因组工程提供了多合一的开放平台。使用荧光素酶lyanum lycopersicum mtb促进剂或Agrobacterium tumefaciens Nopaline benthase prospermers inice inice inice Amamaine inice Amamaine in NiceAtient在NICAPASE中，NICAPASE PROSSITER in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICAPASE in NICASIEN中，NICAIN中的使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。使用单个和多重GRNA的GB组装DCAS9和基于DCAS12A的CRISPR/CAS激活剂和阻遏物使用单一和多路复用GRNA的功能。
IPSC中使用CRISPR的高效精确基因组编辑方法
基因组编辑是生物技术领域中开发的最强大的工具之一。改变生物体的基因组的能力使科学家能够在更复杂的系统中研究挑战性的进化和药用问题1。全基因组关联研究（GWAS）产生了大量的单核苷酸多态性（SNP），与疾病风险增加相关的遗传变异2。基因编辑允许生产含有SNP的基因工程的同源线，这些细胞可能说明了这种遗传突变如何引起疾病。编辑水平从理论上简单的基因敲除到更复杂的编辑，例如完整的基因插入或点突变。尽管基因组编辑技术已经快速提高，但仍未解决的几个挑战3 - 5。群集定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）已成为动植物模型中基因组编辑的首选方法6。当前方法通常使用核酸酶变体Cas9和cas12a 6。CRISPR -CAS9和-CAS12A系统与指南RNA（GRNA）相互作用，该导向RNA（GRNA）由两个段组成：CRISPR RNA（CRRNA）指定基因组靶点位点和反式激活CRISPR RNA（TRACRRNA），这些crispr rna（tracrRNA）直接与CAS与CAS核蛋白结合以形成核糖核蛋白蛋白（RNP）7。与先前的基因改变技术相比，创新的CRISPR-CAS基因编辑技术更简单，更负担得起配置，从而导致了广泛的利用率2、8、9。我们假设我们可以通过抑制p53激活，从而提高编辑效率来改善细胞恢复。然而，尽管CRISPR-CAS编辑系统取得了重大进展，但迫切需要进一步的优化以提高效率和成功编辑的百分比，尤其是当多种风险变体与感兴趣的基因相关联时，就需要通过敲击多个遗传修饰的多种SNP产生具有不同SNP的多线。在这项研究中，我们旨在开发一种高效且易于适应的基因编辑方案，以克服目前限制细胞系中点突变效率的障碍。由于与CRISPR和单细胞克隆10相关的双链染色体断裂而引起的明显细胞死亡。另一方面，据报道，抑制相关激酶（岩石）或p53途径可通过预防细胞死亡8来提高编辑效率8。
在 CRISPR-Cas12a 中，α-螺旋盖引导目标 DNA 进行催化
CRISPR-Cas12a 是一种强大的 RNA 引导基因组编辑系统，它利用其单个 RuvC 核酸酶结构域通过顺序机制产生双链 DNA 断裂，其中非靶链的初始切割随后是靶链切割。目前尚不清楚空间上相距甚远的 DNA 靶链如何向 RuvC 催化核心移动。在这里，连续数十微秒的分子动力学和自由能模拟表明，位于 RuvC 结构域内的 α 螺旋盖通过锚定 crRNA：靶链双链并引导靶链向 RuvC 核心移动，在 DNA 靶链的移动中起着关键作用，DNA 切割实验也证实了这一点。在这种机制中，REC2 结构域将 crRNA：靶链双链推向酶的核心，而 Nuc 结构域通过向内弯曲来帮助靶链在 RuvC 核心内的弯曲和调节。了解 Cas12a 活性背后的这一关键过程将丰富基础知识并促进进一步的基因组编辑工程策略。