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Cas12a 是快速准确病原体检测的未来吗？
CRISPR-Cas12a 能检测 CMV 吗？巨细胞病毒 (CMV) 是一种常见病毒，很少对健康人造成问题。然而，它会给免疫系统较弱的人带来问题，包括接受移植手术的患者和容易将病毒传染给婴儿的孕妇。感染会导致新生儿听力丧失和发育问题。尽管会造成严重缺陷，但在 80% 的病例中，没有明显的感染迹象。当受感染的婴儿未通过听力或认知测试时，就会怀疑有先天性感染。一种可以筛查每个新生儿的快速、经济有效的测试将使临床医生能够识别受感染的婴儿并提供治疗以减少严重并发症。
使用 Cas12a 在果蝇中进行多重条件基因组编辑
* 共同第一作者 § 通讯作者：f.port@dkfz.de 和 m.boutros@dkfz.de 摘要 CRISPR-Cas 基因组工程通过以前所未有的简便性实现靶向基因组修饰，彻底改变了生物医学研究。在流行的模型生物果蝇中，基因编辑迄今为止完全依赖于原型 CRISPR 核酸酶 Cas9。其他 CRISPR 系统的出现可以扩大基因组靶空间，提供额外的调控模式，并能够在同一动物的不同细胞群中独立操作基因。我们在此描述了一个用于果蝇高效 Cas12a 基因编辑的平台。我们表明，来自 Lachnospiraceae 细菌的 Cas12a （而非 Acidaminococcus spec.）可以介导体内强大的基因编辑。与大多数 crRNA 结合时，LbCas12a 活性在较低温度下受到强烈抑制，因此只需调节温度即可控制基因编辑。 LbCas12a 可以直接利用紧凑的 crRNA 阵列，这种阵列比 Cas9 sgRNA 阵列更容易构建，从而有助于同时对多个靶位进行多重基因组工程。使用三个 crRNA 阵列靶向基因会导致功能丧失表型的诱导，其效率与最先进的 Cas9 系统相当。最后，我们表明 LbCas12a 的细胞类型特异性表达足以介导各种组织中严格控制的基因编辑，从而可以详细分析这种多细胞生物中的基因功能。Cas12a 基因编辑大大扩展了这种生物的基因组工程工具箱，并将成为对果蝇基因组进行功能注释的有力方法。这项工作还为在其他遗传上可驯服的生物中开发多重转基因 Cas12a 基因组工程系统奠定了基础。关键词：Cas12a、果蝇、Cas9、基因组工程、CRISPR、诱变
CRISPR/Cas12a (Cpf1) 引导RNA序列的鉴定
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）或 CRISPR 相关（Cas）系统已成为一种主要的基因编辑工具。使用 CRISPR 进行基因编辑需要 Cas 蛋白和相应的向导 RNA（gRNA）。然而，低切割效率和脱靶效应会阻碍 CRISPR/Cas 系统的应用。因此，确定特定的 gRNA 至关重要。在生物传感器应用中，由于 Cas12a（Cpf1）的反式切割活性，CRISPR/Cas12a 可以增强识别靶基因的特异性和灵敏度。mtDNA D 环序列是 mtDNA 中最易变的部分，使其适合区分物种。因此，本研究的目的是通过计算机模拟确定野猪 mtDNA D 环的 gRNA 序列。在 GenBank 数据库的帮助下，使用 Benchling 应用程序预测候选 gRNA。随后，使用 BLAST 核苷酸对 gRNA 候选物进行同源性差异分析，并使用 Jalview 进行错配测试。在几个候选物中，候选物 1 被选为最佳选择，脱靶值为 99.8。与竞争对手的同源性差异分析和与 Sus 属的错配测试分别产生了较高的 E 值和较高的百分比值。这表明候选物不会识别其他物种，但可以检测 Sus scrofa 物种的成员。这些 gRNA 候选物可以选择性地且灵敏地应用于生物传感器，以检测肉类掺假。
IN4MER CRISPR/Cas12a 多重敲除平台
高效基因敲除和遗传相互作用：IN4MER CRISPR/Cas12a 多重敲除平台 Nazanin Esmaeili Anvar 1,2,* , Chenchu Lin 1,* , Xingdi Ma 1,2,* , Lori L. Wilson 1 , Ryan Steger 3 , Annabel K. Sangree 3 , Medina Colic 1 , Sidney H. Wang 4 , John G. Doench 3 , Traver Hart 1,5,6
改造 Cas12a 核酸酶变体，增强基因组编辑特异性
AU：请确认所有标题级别均正确显示：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas12a 系统是基因编辑的强大工具；然而，crRNA-DNA 错配可能会引起不必要的切割事件，尤其是在 PAM 的远端。为了最大限度地减少这种限制，我们通过修改与靶 DNA 和 crRNA 链相互作用的氨基酸残基，设计了一种携带突变 S186A/R301A/T315A/Q1014A/K414A 的超保真 AsCas12a 变体（称为 HyperFi-As）。HyperFi-As 保留了与人类细胞中的野生型 AsCas12a (AsCas12aWT) 相当的靶向活性。我们证明 HyperFi-As 显著降低了人类细胞中的脱靶效应，并且与野生型相比，HyperFi-As 对 PAM 远端区域位置的错配容忍度明显较低。此外，采用改进的适当恒定力单分子 DNA 解拉链分析来评估 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 复合物的稳定性和瞬态阶段。在 DNA-Cas12a-crRNA 复合物的解体过程中敏感地检测到了多种状态。在脱靶 DNA 底物上，与 AsCas12aWT 相比，HyperFi-As-crRNA 更难维持 R 环复合物状态，这可以准确解释为什么 HyperFi-As 在人类细胞中具有较低的脱靶效应。我们的研究结果提供了一种具有低脱靶效应的新型 AsCas12a 变体，尤其能够处理 PAM 远端区域的高脱靶。在单分子水平上，我们还揭示了 AsCas12a 变体在脱靶位点的行为方式，而用于评估 CRISPR/Cas RNP 复合物多种状态的解压缩分析可能对深入了解 CRISPR/Cas 的行为方式以及将来如何对其进行工程改造大有帮助。
使用 Cas12a 核酸酶的下一代 CRISPR 基因驱动系统
图 1. 基于 Cas12a 的基因驱动显示出受温度调节的超孟德尔遗传率。（a）CopyCat 基因驱动系统示意图。DsRed 标记的 Cas12a 是一种静态转基因，它通过等位基因转换提供复制 GFP 标记的 CopyCat 元素的核酸酶，而等位基因转换由周围的同源臂驱动。（b）表达 Cas12a 的雄性与携带黑檀木 CopyCat 构建体（e1 或 e4 基因驱动）的处女雌性杂交方案。收集的处女雌性（Cas12a-dsRed + 基因驱动-GFP）与黑檀木突变雄性杂交，通过筛选 F2 后代中的 GFP 标记来评估种系传递率。深灰色半箭头表示雄性 Y 染色体。F1 雌性中的绿色三角形表示潜在的基因驱动复制到野生型染色体上。 (c) 通过对 GFP 标记的乌木 CopyCat 构建体的 F2 后代进行表型评分，评估 F1 雌性生殖系中的基因驱动活性。遗传率测量值与平均遗传率 (%)（也以黑条表示）和进行的 F1 杂交次数 (n) 一起报告在图表顶部。
一种用于体内基因组编辑的新型紧凑型 Cas12a 变体
为了使通过腺相关病毒 (AAV) 载体进行的基因治疗取得成功，载体基因组大小是一个主要制约因素，因为它会阻止将较大的转基因包装到二十面体病毒衣壳中。在基于 CRISPR 的基因组编辑背景下，已经描述了多种紧凑型 Cas 变体，例如 Cas12j (CasPhi) 或 Cas12f (CasMINI) [ 1 , 2 ]，它们可用于通过 AAV 递送进行体内基因组编辑。在 Wang 等人的研究中 [ 3 ]，一种来自丹毒菌 (EbCas12a) 的新型紧凑型 Cas12a 变体被表征为当通过点突变 (enEbCas12a) 改进时，显示出与其他 Cas12a 变体相似的编辑效率 [ 3 ]。值得注意的是，EbCas12a 的编码序列比下一个更大的已表征 Cas12a 变体小约 150 bp（图 1），有利于将其容纳在“一体化” AAV 载体中，该载体在单个 AAV 模板上提供 Cas12a 和 crRNA。通过使用单一载体给药，作者证明了新型 AAV-enEbCas12a 载体介导体内基因组编辑的能力，从而为不断扩展的 CRISPR 工具箱增加了一个新条目。首先，作者通过体外切割试验表征了 EbCas12a，并确定 TTTV（V = G、C 或 A）为 PAM 序列，这与其他已报道的 Cas12a 系统类似。接下来，EbCas12 被证明在培养的哺乳动物细胞中具有功能性，这通过两个报告基因和各种基因组位点的切割得到证实。然而，与其他 Cas12a 变体（例如常用的 AsCas12a 和 LbCas12a）相比，EbCas12a 效率较低。因此，为了放宽 PAM 序列限制并提高 AsCas12a 的编辑效率，作者们在 EbCas12a 中替换了一个氨基酸，以建立 PAM 近端 DNA 接触，从而产生了变体 enEbCas12a。事实上，这种单点突变将基因组位点的编辑效率提高了约 2 倍。然而，与此同时，放宽 PAM 序列限制可能会增加 enEbCas12a 脱靶编辑的风险。为了通过实验检验这一担忧，对脱靶编辑事件进行了全基因组分析。值得注意的是，检测到的脱靶位点数量为
Cas12a 与 Cas9 介导的番茄细胞诱变比较
记录版本：该预印本的版本于 2024 年 2 月 24 日在 Scienti¦c Reports 上发布。已发布的版本请参阅 https://doi.org/10.1038/s41598-024-55088-4 。
Cas12a/Cpf1 敲入小鼠可实现高效多路复用......
1. 美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院遗传学系 2. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学系统生物学研究所 3. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学癌症系统生物学中心 4. 医学博士 (MD-Ph.D.)耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州西黑文 5. 耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州纽黑文 6. 耶鲁大学免疫生物学系，美国康涅狄格州纽黑文 7. 耶鲁大学分子细胞生物学、遗传学与发展项目，美国康涅狄格州纽黑文 8. 耶鲁大学耶鲁学院，美国康涅狄格州纽黑文 9. 耶鲁大学医学院神经外科系，美国康涅狄格州纽黑文 10. 耶鲁大学医学院耶鲁综合癌症中心，美国康涅狄格州纽黑文 11. 耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心，美国康涅狄格州纽黑文 12. 耶鲁大学医学院耶鲁生物医学数据科学中心，美国康涅狄格州纽黑文 ^ 现地址：中国湖南长沙湘雅医学院 * 共同第一作者 @ 通信：
工程CRISPR/CAS12A启用快速SARS-COV-2检测
致谢：我们感谢Jain Lab的成员提供有用的建议和讨论。我们感谢佛罗里达大学，UF健康癌症中心和临床和转化科学研究所存储库的支持。我们还要感谢David Ostrov博士和Cuong Nguyen博士的支持，并获得了患者样本并进行讨论。 最后，我们感谢惠特尼·斯托佩尔（Whitney Stoppel）博士和她在化学工程系的实验室和佛罗里达大学森林基因组学集团的Chrisopher Dervinis博士使用冻干剂。 通过BEI资源，NIAID，NIH：中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-COV），EMC/2012，NR-45843获得以下试剂。来自Urbani，Urbani，NR-52346的定量PCR（QPCR）控制RNA；来自人类冠状病毒（HCOV）的基因组RNA，NL63，NR-44105；来自SARS相关冠状病毒2的基因组RNA，孤立的香港/VM20001061/2020，NR-52388。 以下试剂是由疾病控制和预防中心沉积的，并通过BEI资源，NIAID，NIH：与SARS相关冠状病毒2，分离的USA-WA1/ 2020，NR-52285的BEI资源：基因组RNA。来自热灭活SARS相关的冠状病毒2，分离株USA-WA1/2020，NR 52347的定量PCR（QPCR）对照RNA；与SARS相关的冠状病毒2，分离的USA-WA1/2020，热灭活，NR-52286。 通过Bei Resources，NIAID，NIH：与SARS相关的冠状病毒2，Inalaly Italy-Inmi1，NR-52498分离出Maria R. Capobianchi博士的基因组RNA。我们还要感谢David Ostrov博士和Cuong Nguyen博士的支持，并获得了患者样本并进行讨论。最后，我们感谢惠特尼·斯托佩尔（Whitney Stoppel）博士和她在化学工程系的实验室和佛罗里达大学森林基因组学集团的Chrisopher Dervinis博士使用冻干剂。通过BEI资源，NIAID，NIH：中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-COV），EMC/2012，NR-45843获得以下试剂。来自Urbani，Urbani，NR-52346的定量PCR（QPCR）控制RNA；来自人类冠状病毒（HCOV）的基因组RNA，NL63，NR-44105；来自SARS相关冠状病毒2的基因组RNA，孤立的香港/VM20001061/2020，NR-52388。以下试剂是由疾病控制和预防中心沉积的，并通过BEI资源，NIAID，NIH：与SARS相关冠状病毒2，分离的USA-WA1/ 2020，NR-52285的BEI资源：基因组RNA。来自热灭活SARS相关的冠状病毒2，分离株USA-WA1/2020，NR 52347的定量PCR（QPCR）对照RNA；与SARS相关的冠状病毒2，分离的USA-WA1/2020，热灭活，NR-52286。通过Bei Resources，NIAID，NIH：与SARS相关的冠状病毒2，Inalaly Italy-Inmi1，NR-52498分离出Maria R. Capobianchi博士的基因组RNA。