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LNP递送CRISPR/CAS12A用于肌动蛋白相关的青光眼的潜在治疗
o 2％–5％的POAG患者在肌动蛋白基因中患有突变，估计为54,000-135,000例患者1,2,4,5 1。风扇和Wiggs。J Clin Invest 2010; 120（9）：3064。2。Weinreb等。JAMA 2014; 311（18）：1901。 3。 家庭和工作验光护理。 可在以下网址提供：https：//homenworkoptometrycare.wordpress.com/2016/10/11/11/overview--primary-open-open-angle-glaucoma/。 2024年5月访问。 4。 指尖等。 人类分子遗传学1999; 8：899。 5。 青光眼：事实和数字。 可用：https：//www.brightfocus.org/glaucoma/article/glaucoma-facts-figures。 2024年5月访问。JAMA 2014; 311（18）：1901。3。家庭和工作验光护理。可在以下网址提供：https：//homenworkoptometrycare.wordpress.com/2016/10/11/11/overview--primary-open-open-angle-glaucoma/。2024年5月访问。4。指尖等。人类分子遗传学1999; 8：899。5。青光眼：事实和数字。可用：https：//www.brightfocus.org/glaucoma/article/glaucoma-facts-figures。2024年5月访问。
使用 CRISPR 阵列分离器增强 Cas12a 多基因调控
图 1. crRNA 性能受上游间隔物的 GC 含量影响 (A) CRISPR-Cas12a 操纵子由 Cas 基因和一个 CRISPR 阵列组成。(B) 每个 crRNA 由一个重复序列和一个间隔物组成。预处理重复序列包含一个 ~16-18-nt 片段，此处称为 CRISPR 分隔符，该片段由 Cas12a 和一种未知酶切除。(C) 在哺乳动物细胞中表达 Cas12a 阵列时，之前已省略了分隔符。我们想了解分隔符是否有助于使 crRNA 免受间隔物中二级结构的负面影响。(D) 我们设计了由两个 crRNA 组成的 CRISPR 阵列，第一个具有非靶向无义间隔物，第二个靶向 GFP 启动子，该启动子在 HEK293T 细胞中基因组整合。(E) 实验设置；分析 GFP 荧光作为阵列性能的衡量标准。 (F) CRISPR 阵列可以显示出对无义间隔物的组成的超敏感性。在极端情况下，将最后一个核苷酸从 T 替换为 G 可能导致 GFP 激活几乎完全终止。(G) 51 个 CRISPR 阵列的文库，其中第一个 crRNA 包含一个具有不同 GC 含量的无义间隔物，第二个 crRNA 靶向 GFP。无义间隔物的 GC 含量与 GFP 荧光之间存在强烈的负相关性。每个点代表 51 个 CRISPR 阵列中的一个（三个重复）。根据阵列启用的 GFP 荧光水平将阵列分为三组。框表示在 I 和 J 中分析的两组。(HJ) 对于每个组，计算了滑动 5-nt 窗口的平均 GC 含量。性能最佳的阵列是无义间隔物在其 3' 端恰好具有低 GC 含量的阵列。一些阵列因其无义间隔物的 GC 含量 ( G ) 而显示出意外的高或低 GFP 活性。这些阵列在其无义间隔物的 3' 端含有低 ( I ) 或高 ( J ) GC 含量，这表明最后几个碱基的 GC 含量是阵列性能的重要预测因素。HJ 中的阴影区域表示标准误差。( K ) 了解无义 crRNA 中 3-nt 区域 GC 含量的预测能力 (方法)。( L ) 显示预测的二级结构 (-Δ(最小自由能)) 和 51 个无义间隔物的 GC 含量之间关系的图。
通过工程CAS12A元基因组发现的cas12a直系同源
1农业动物遗传学，育种和繁殖，教育部和猪遗传学和育种部关键实验室，农业和农村事务部，瓦兹洪农业大学，430070 Wuhan，P.R。R.中国。2 Yazhouwan国家实验室（YNL），Sanya Hainan 572025，P。R.China。 3瓦兹胡农业大学的可持续猪生产合作创新中心，430070 Wuhan，P。R.中国。 4 Hubei Hongshan实验室，Huazhong农业大学，Wuhan 430070，P。R.China。 5胰腺疾病实验室，吉安格大学医学院第一家附属医院，杭州310058，P。R.China。 这些作者也同样贡献：Dagang Tao，Bingrong Xu，Sheng Li和Hailong Liu。 *电子邮件：ssxie@mail.hzau.edu.cn; shzhao@mail.hzau.edu.cn; xyli@mail.hzau.edu.cn2 Yazhouwan国家实验室（YNL），Sanya Hainan 572025，P。R.China。3瓦兹胡农业大学的可持续猪生产合作创新中心，430070 Wuhan，P。R.中国。4 Hubei Hongshan实验室，Huazhong农业大学，Wuhan 430070，P。R.China。 5胰腺疾病实验室，吉安格大学医学院第一家附属医院，杭州310058，P。R.China。 这些作者也同样贡献：Dagang Tao，Bingrong Xu，Sheng Li和Hailong Liu。 *电子邮件：ssxie@mail.hzau.edu.cn; shzhao@mail.hzau.edu.cn; xyli@mail.hzau.edu.cn4 Hubei Hongshan实验室，Huazhong农业大学，Wuhan 430070，P。R.China。5胰腺疾病实验室，吉安格大学医学院第一家附属医院，杭州310058，P。R.China。这些作者也同样贡献：Dagang Tao，Bingrong Xu，Sheng Li和Hailong Liu。*电子邮件：ssxie@mail.hzau.edu.cn; shzhao@mail.hzau.edu.cn; xyli@mail.hzau.edu.cn
基因组编辑-Alt -R为CAS12A（CPF1）超核酸酶-Net
图1。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。 DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。 如Alt-R CRISPR-CAS12A用户指南中所指示的RNP 人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。 使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。编辑效率。
通过使用 CRISPR/Cas12a 可以增强植物体内基因靶向
通过同源重组 (HR) 控制植物基因组的改变仍然很难实现。我们之前开发了植物内基因打靶 (ipGT) 技术，该技术依赖于通过双链断裂同时激活目标基因座和切除目标载体。尽管使用 SpCas9 会导致拟南芥中的 ipGT 频率较低，但我们最近能够通过使用卵细胞特异性表达强效但适用范围较广的 SaCas9 核酸酶来提高效率。在这项研究中，我们现在测试了是否可以进一步改进 ipGT，方法是在染色体内 HR 效率增强的细胞中进行，或者使用 Cas12a，这是一种具有替代切割机制的不同类型的 CRISPR/Cas 核酸酶。我们之前可以证明植物具有三种 DNA ATPase 复合物，如果因突变而丢失，它们都会导致同源基因组重复不稳定性。由于这些蛋白质以独立途径发挥作用，我们在双突变体中测试了 ipGT，其中染色体内 HR 增强了 20 至 80 倍。然而，我们无法获得更高的 ipGT 频率，这表明基因靶向 (GT) 和染色体重复诱导 HR 的机制不同。然而，使用 LbCas12a，尽管非同源末端连接 (NHEJ) 诱导效率较低，但 GT 频率高于 SaCas9，表明 Cas12a 特别适合诱导 HR。由于 SaCas9 因其较长的富含 GC 的 PAM 序列而受到很大限制，因此使用富含 AT 的 PAM 的 LbCas12a 可以大大拓宽 ipGT 的范围，尤其是在靶向启动子和内含子等 CG 沙漠时。
CAS12A R环的结构基础在DNA裂解途径上
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2023年3月13日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.03.13.13.532460 doi：Biorxiv Preprint
CAS12A R环的结构基础在DNA裂解途径上
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。该预印本版的版权持有人于2023年6月22日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.03.13.13.532460 doi：Biorxiv Preprint
CRISPR CAS9和CAS12A同源指导维修的优化设计参数
CRISPR – CAS蛋白是用于在靶向基因组基因座上引入双链断裂（DSB）的RNA引导的核酸酶。DSB通过内源性细胞途径（例如非同源末端连接（NHEJ）和同源指导修复（HDR））修复。在修复过程中提供外源DNA模板，可以通过HDR途径有意，精确地掺入所需的突变。但是，与更快但准确的NHEJ介导的修复相比，HDR的维修率通常很慢。在这里，我们使用单链寡脱氧核苷酸（SSODN）供体模板描述了全面的设计注意事项和优化的高效HDR方法，用于包括S.P.Cas9，S.P。 cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。 针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。 这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。 工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdrCas9，S.P。cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdr
基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的 ...
恒温扩增核酸检测技术因其耗时短、对扩增 设备要求低和引物探针商品化合成稳定等优势 , 在 病原快速检测技术中脱颖而出。 Piepenburg 等 [ 13 ] 参 照 T4 噬菌体 DNA 复制系统于 2006 年创建了一种新 型等温扩增技术 , 使用酶来打开双链 DNA, 该技术 称为重组酶聚合酶扩增 (Recombinase polymerase am- plification, RPA) 。随后发明的重组酶介导链置换 核酸扩增技术 (Recombinase-aid amplification, RAA) 技术原理与 RPA 类似 , 不同之处在于 RAA 的重组酶 来源于细菌或真菌 , 而 RPA 的重组酶来自 T4 噬菌 体。 2017 年 [ 14 ] 结合以上重组酶 , SHERLOCK (Specifi- chigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking) 检测 方案问世 , 并应用于新冠病毒的检测技术开发 [ 15 ] , 该技术通过改造规律间隔成簇短回文重复序列及 其关联蛋白 (Clustered regularly interspaced short pa- lindromic repeats/CRISPR-associated proteins system, CRISPR/Cas) 系统 , 使其能够识别特定的严重急性 呼吸综合征冠状病毒 2 (Severe acute respiratory syn- drome coronavirus 2, SARS-Cov-2) 基因组片段 , 1h 就能确定检测结果 , 检测限可低至 2 amol/L 。 SHER- LOCK 技术特异和简便 , 将 SHERLOCK 与 RAA 整合 集成 , 能够凸显两者的优势 , 不仅可以实现靶标核 酸的快速扩增 ( 保留等温扩增技术的优势 ), 还增强 了检测特异性。
Cas12a 直系同源物和工程变体的高通量分析，以增强基因组编辑活性
摘要：CRISPR/Cas12a（以前称为 Cpf1）是一种 RNA 引导的 VA 类 CRISPR 系统内切酶，为基因组工程提供了一种有前途的工具。目前已鉴定出 10 多个 Cas12a 直系同源物，并用于人类细胞的基因编辑。然而，新兴 Cas12a 直系同源物之间的功能多样性仍未得到充分探索。本文，我们通过构建包含 40,000 多个引导 RNA 的基因组整合、自切割、配对 crRNA 靶标文库，报告了 16 个 Cas12a 直系同源物在人类细胞中的编辑活性的高通量比较分析。三种 Cas12a 候选物由于其结构紧凑且编辑效率与 AsCas12a 和 LbCas12a 相当而表现出良好的潜力，而 AsCas12a 和 LbCas12a 的特征已得到充分表征。我们通过结构引导的蛋白质工程生成了三种精氨酸替代变体 (3Rv)：BsCas12a-3Rv (K155R/N512R/K518R)、PrCas12a-3Rv (E162R/N519R/K525R) 和 Mb3Cas12a-3Rv (D180R/N581R/K587R)。与野生型 Cas12a 效应子相比，这三种 Cas12a 变体均表现出增强的编辑活性和扩大的靶向范围 (NTTV、NTCV 和 TRTV)。三种 Cas12a 变体之间的碱基偏好分析表明，PrCas12a-3Rv 在具有典型 PAM TTTV 和非典型 PAM TTCV 的靶位点上表现出最高活性，而 Mb3Cas12a-3Rv 表现出与其他变体不同的识别特征，在 PAM TATV 的 -3 位置和 PAM ATCV 的 -4 位置容纳更多的核苷酸 A。因此，扩展的 Cas12a 工具箱和对 Cas12a 活动的更好理解应该有助于它们在基因组工程中的应用。