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World File Search SystemCAS12A
通过裂域 CRISPR–Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，可以设计 gRNA 开关来感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。
活细胞成像揭示了 Cas9 和 Cas12a 靶标搜索灵活性与效率之间的权衡
摘要 CRISPR-Cas 系统已被广泛用作基因组编辑工具，其中两种常用的 Cas 核酸酶是 Spy Cas9 和 Lb Cas12a。虽然这两种核酸酶都使用 RNA 向导来寻找和切割靶 DNA 位点，但这两种酶在原间隔区相邻基序 (PAM) 要求、向导结构和切割机制方面有所不同。在过去的几年里，合理工程设计导致了 PAM 放宽变体 Sp RYCas9 和 imp Lb Cas12a 的诞生，以拓宽可靶向的 DNA 空间。通过使用它们的催化无活性变体 (dCas9/dCas12a)，我们量化了蛋白质特异性特征如何影响靶标搜索过程。为了进行量化，我们将这些核酸酶与光激活荧光蛋白 PAmCherry2.1 融合，并在大肠杆菌细胞中进行单粒子追踪。通过跟踪分析，我们推导出了每种具有非靶向 RNA 向导的核酸酶的动力学参数，这强烈表明 Lb dCas12a 变体对 DNA 的询问比 Spy dCas9 更快。在存在靶向 RNA 向导的情况下，模拟和细胞成像均证实 Lb dCas12a 变体在找到特定靶位点方面更快、更高效。我们的工作展示了使用强大的框架工作放宽 Spy dCas9 和 Lb dCas12a 中的 PAM 要求的权衡，这可以应用于其他核酸酶以量化它们的 DNA 靶标搜索。
CAS12A的反式DNA裂解活性没有可检测到的免疫力对质粒或噬菌体
CAS12A是V-A型CRISPR-CAS RNA引导的内切酶。它在特定位点切割了dsDNA，然后在体外反式跨体内激活以非特征ssDNA的裂解。反式活性的免疫功能仍然未知。为了解决这个问题，我们在大肠杆菌中构建了一个CAS12A靶向系统，其中CAS12A裂解了高拷贝靶质粒以释放反式ssDNA裂解活性。然后，我们分析了Cas12a靶向对非目标质粒和ssDNA噬菌体的影响。结果表明，CAS12A有效地消除了目标质粒，但对噬菌体的非目标质粒或鼠疫形成的维持没有影响。此外，有助于靶质粒耗竭的两间隔crispr阵列仍然对非目标质粒或噬菌体没有可检测的影响。一起，数据表明CAS12A的反式ssDNA切割不会导致体内免疫力。
通过裂解 CRISPR RNA 编程的 V 型 Cas12a 效应子进行有效的靶向切割
1 斯科尔科沃科学技术学院生命科学中心，莫斯科 143026，俄罗斯，2 UMR7156 - 分子遗传学、基因组学、微生物学，斯特拉斯堡大学和法国国家科学研究中心 (CNRS)，斯特拉斯堡 67000，法国，3 罗格斯新泽西州立大学瓦克斯曼微生物研究所，皮斯卡塔韦 08854，美国，4 白俄罗斯国家科学院物理有机化学研究所生物共轭化学实验室，明斯克 220072，白俄罗斯，5 库尔恰托夫基因组学中心，国家研究中心“库尔恰托夫研究所”，莫斯科 123098，俄罗斯，6 莫斯科罗蒙诺索夫国立大学生物学院，莫斯科 119991，俄罗斯和 7 俄罗斯科学院基因生物学研究所精准基因组编辑和生物医学遗传技术中心科学院，莫斯科 119334，俄罗斯
基于CAS12A的基因编辑系统，用于疫霉菌Infestans揭示了诱发仪的单相表达
fi g u r e 1在疫霉菌中核酸内切酶的表达表达。（a）五个代表性菌株的免疫印迹，用编码编码绿色荧光蛋白（GFP）标记的核酸酶的催化型核酸酶，PSNLS-DCAS9-GFP的质粒转化，用抗GFP探测。nc1和nc2是阴性对照，即分别表达另一种蛋白质和未转化的1306的菌株。蛋白质的预期大小为194 kDa。（b）表达PSNLS-DCAS9-GFP的转化剂的荧光显微照片，显示蛋白质在菌丝内的核的定位。GFP，明亮的场和合并的通道被上下显示，比例尺等于10 µm。 （c）用抗Cas12a探测的质粒转化的菌株的免疫印迹。nc是未转化的祖细胞菌株。从图像中删除了T9和NC之间的一个空车道。蛋白质的预期大小为153 kDa。（d）表达PSNLS-CAS12A-GFP的转化剂的共聚焦图像，显示左侧的菌丝，右侧显示孢子囊。GFP，明亮的场和合并的通道被上下显示，比例尺等于10 µm
简单促进Cas9和cas12a表达通过多合一策略改善基因靶向
基因靶向（GT）是精确操纵基因组序列的有前途的工具，但是，种子植物中的GT仍然是一项艰巨的任务。通过同源指导修复（HDR）提高GT效率的简单而直接的方法是增加植物目标部位的双链断裂（DSB）的频率。在这里，我们通过结合CAS表达的转录和翻译增强子来报告拟南芥中GT的一种多合一方法。我们发现，通过使用增强剂来促进Cas9和cas12a变体的表达可以改善拟南芥基因组中的DSB和随后的敲门效率。这些结果表明，在特定时机（卵细胞和早期胚胎）下，简单地增加CAS蛋白表达可以改善可遗传的GTS的建立。这种简单的方法允许在植物中进行常规的基因组工程。
通过 Cas12a/CBE 共编辑在 T0 代中产生无转基因抗溃疡病 Citrus sinensis cv. Hamlin
柑橘溃疡病影响柑橘生产。该病由柑橘黄单胞菌（Xcc）引起。先前的研究证实，在 Xcc 感染期间，转录激活因子样效应物 (TALE) PthA4 会从病原体转移到宿主植物细胞中。PthA4 与溃疡病易感基因 LOB1（EBE PthA4 -LOBP）启动子区中的效应物结合元件 (EBE) 结合，激活其表达，随后引起溃疡症状。之前，采用 Cas12a/CBE 共编辑方法破坏高度纯合的柚子的 EBE PthA4 -LOBP。然而，大多数商业柑橘品种都是杂合杂交种，更难产生纯合/双等位基因突变体。在这里，我们采用 Cas12a/CBE 共编辑方法来编辑 Hamlin（Citrus sinensis）的 EBE PthA4 -LOBP，这是一种在世界范围内种植的商业杂合柑橘品种。构建了二元载体 GFP- p1380N-ttLbCas12a:LOBP1-mPBE:ALS2:ALS1，并证明其可通过 Xcc 促进的农杆菌素过滤在 Hamlin 叶片中发挥作用。该构建体允许通过 GFP 选择无转基因再生体，编辑 ALS 以生成抗氯磺隆再生体作为基因组编辑的选择标记，这是通过 nCas9-mPBE:ALS2:ALS1 瞬时表达 T-DNA 的结果，并通过 ttLbCas12a 编辑感兴趣的基因（即本研究中的 EBE PthA4 -LOBP），从而产生无转基因柑橘。共产生了 77 株幼苗。其中 8 株幼苗为转基因植株（#Ham GFP 1 - #Ham GFP 8），4 株幼苗为非转基因植株（#Ham NoGFP 1 - #Ham NoGFP 4），其余为野生型。在 4 株非转基因幼苗中，三个品系（#Ham NoGFP 1、#Ham NoGFP 2 和 #Ham NoGFP 3）含有 EBE pthA4 的双等位基因突变，一个品系（#Ham NoGFP 4）含有 EBE pthA4 的纯合突变。我们在 C. sinensis cv. Hamlin 中实现了 EBE PthA4 – LOBP 的 5.2% 非转基因纯合/双等位基因突变效率，而之前研究中柚子的突变效率为 1.9%。重要的是，存活下来的 4 株无转基因植株和 3 株转基因植株均能抵抗柑橘
2′-O-甲基修饰的向导RNA增强CRISPR-Cas12a系统的单核苷酸多态性(SNP)鉴别能力
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白是细菌和古菌所特有的，构成了针对外来移动遗传元素的适应性免疫系统。1,2 CRISPR-Cas 系统分为第 1 类（使用多个 Cas 蛋白）和第 2 类系统（使用单个多结构域 Cas 蛋白），根据复杂性和特征蛋白又细分为六种类型（I 型至 VI 型）。3 作为第 2 类系统的成员，II-A 型 CRISPR-Cas9 得到了最广泛的研究和开发，成为基因组编辑和治疗工具。 4 Cas9 具有两个核酸酶位点——His – Asn – His (HNH) 和 RuvC 样结构域，可在双 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (transcrRNA) 向导介导的特定位点实现双链 DNA (dsDNA) 的精确切割。5,6
基于 CRISPR/Cas12a 的生物传感器用于环境监测和诊断
污染物（例如核酸或有毒小分子）威胁着人类健康和环境。精确且高度灵敏地识别此类污染物对于保障食品安全、促进诊断和监测环境条件等各个领域都至关重要。传统方法包括光谱复制、色谱分析、测序和宏基因组学，在检测过程中发挥着关键作用。然而，这些方法在灵敏度、特异性和可移植性方面遇到了反复出现的挑战。本综述重点介绍具有突破性的基于 CRISPR/Cas 的生物传感器。这些生物传感器利用 CRISPR/Cas 系统的惊人精度和可编程性来识别特定目标。在这里，我们全面评估了实现特定和准确检测的基本机制，涵盖从向导 RNA 设计到优化侧裂解活性等主题。CRISPR/Cas12a 生物传感器的多功能性通过其多种应用变得显而易见。这些应用包括医疗诊断、食品安全和环境监测。从传统检测方法到生物传感器，再到 CRISPR/Cas 生物传感器的转变，代表了多种污染物检测领域的一个重要里程碑。通过结合分子生物学、纳米技术和生物信息学，这些生物传感器有可能重塑水安全、诊断和环境监测的格局。CRIPSR-Cas 诊断是一项变革性技术，为环境和人类生活更安全、更健康的未来铺平了道路。
利用 PCR 毛细管凝胶电泳高通量基因分型追踪苹果中 CRISPR/Cas12a 介导的基因组编辑事件
摘要：使用新型 CRISPR/Cas12a 系统具有优势，因为它与常用的 CRISPR/Cas9 系统相比具有不同的特点，从而扩展了基因组编辑 (GE) 应用的可能性。在这项工作中，CRISPR/Cas12a 系统首次应用于苹果，以研究其在 GE 应用中的普遍可用性。通过体外切割试验预先筛选出针对内源报告基因 MdPDS 不同外显子的有效引导 RNA，该基因的破坏会导致白化表型。将一个构建体转移到苹果中，该构建体编码 CRISPR/Cas12a 系统，该系统同时靶向 MdPDS 中的两个基因座。使用荧光 PCR 毛细管电泳和扩增子深度测序，所有已鉴定的再生白化芽的 GE 事件都被描述为缺失。未观察到两个相邻靶位点之间的大量缺失。此外，还经常观察到表现出多个 GE 事件的再生体和芽的嵌合组成。通过比较两种分析方法，结果表明荧光 PCR 毛细管凝胶电泳是一种灵敏的高通量基因分型方法，可以同时准确预测多个位点的插入/缺失突变的大小和比例。特别是对于表现出高嵌合频率的物种，可以推荐将其作为有效选择同型组蛋白 GE 系的经济有效的方法。