XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemCAS12A
IDT 宣传册 4 第 1 页
Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，2 nmol Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，10 nmol Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，2 nmol Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，10 nmol Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，2 nmol，板 Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，10 nmol，板 Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，10 nmol，板 Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，2 nmol，板
使用可诱导 Cas12a 敲除筛选识别驱动上皮向间质转变的基因组合 Jun Lin (导师：Abhishek Iy
转移是指癌症扩散至不同器官。转移性肿瘤通常是致命的，并且难以通过常规手术或药物治疗¹。转移的一个关键前兆是上皮-间质转化 (EMT)。上皮细胞含有紧密连接并相互粘附。间质细胞是可移动细胞，可通过循环系统或其他身体系统迁移到身体的不同部位。癌症中的 EMT 是上皮癌细胞转变为间质样状态，从而导致癌症离体扩散至全身²。这些间质癌细胞可能定位到远处器官，在那里它可以进行间质-上皮转化 (MET) 形成肿瘤。EMT 通常是多个基因而非一个基因的结果，它们之间的复杂性尚不清楚³。更深入地研究 EMT 激活周围的基因网络将有助于提高对其机制和潜在疗法的认识。因此，必须进行更多研究来确定可导致 EMT 的基因组合。
优化 ErCas12a 以实现拟南芥中的高效基因编辑
摘要 Er Cas12a 核酸酶，也称为 MAD7，是来自直肠真杆菌的 CRISPR/Cas 系统的一部分，与 Cas12a 核酸酶有远亲关系。由于它与常用的 As Cas12a 仅有 31% 的序列同源性，其知识产权可能不受 Cas12a 核酸酶授予的专利权的保护。因此，Er Cas12a 成为实际应用的一个有吸引力的替代品。然而，Er Cas12a 的编辑效率强烈依赖于靶序列和温度。因此，通过蛋白质工程优化酶活性对于其在植物中的应用尤其有吸引力，因为它们是在较低温度下培养的。基于从 Cas12a 核酸酶优化中获得的知识，我们选择通过引入类似的氨基酸交换来提高 Er Cas12a 的基因编辑效率。有趣的是，这些与 As Cas12a 增强版或 Ultra 版类似的突变均未导致拟南芥中 Er Cas12a 的编辑显著增强。然而，酶假定的 α 螺旋结构中的两个不同突变 V156R 和 K172R 显示出可检测到的编辑改善。通过结合这两个突变，我们获得了改进的 Er Cas12a (im Er Cas12a) 变体，与拟南芥中的野生型酶相比，其活性增加了几倍。该变体在 22°C 时具有很强的编辑效率，通过将培养温度升高到 28°C 可以进一步提高，甚至可以编辑以前无法接近的目标。此外，没有检测到增强的场外活动。因此，im Er Cas12a 是一种经济上有吸引力且有效的植物基因组工程其他 CRISPR/Cas 系统的替代方案。
使用新型 Lb Cas12a 变体对大麦进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响 Tom Lawrenson、Alison Hinchliffe、Macarena
CRISPR、Cas12a、CPF1、大麦、诱变、单子叶植物、基因组编辑摘要我们报告了首次成功、高效使用大麦中的 Lb Cas12a，并描述了两种新型 Cas12a 变体的开发和应用。总共我们使用二十种不同的指南比较了五种编码序列 (CDS) 变体，包括两种新型变体和两种指南架构，针对 5 种不同的靶基因。我们发现不同 CDS 版本 (0-87%) 和指南架构 (0-70%) 之间的编辑效率存在很大差异，并且表明我们的两个新型 CDS 版本在该物种的测试中大大优于其他版本。我们展示了产生的突变的遗传性。我们的研究结果强调了优化单个物种的 CRISPR 系统的重要性，并可能有助于在其他单子叶植物中使用 Lb Cas12a。正文 毛螺菌科细菌 Cas12a (Lb Cas12a) 可能是继化脓性链球菌 Cas9 (Sp Cas9) 之后植物基因组编辑中第二广泛使用的可编程核酸酶，并且具有一些潜在优势。首先，由于其对 TTTV PAM 的要求与 NGG 的 Sp Cas9 要求不同，它可用于 GC 沙漠，而 GC 沙漠通常存在于内含子、UTR 和启动子区域中。其次，Lb Cas12a 通常比 Sp Cas9 产生更大的缺失，这可能在缺失研究中有用。第三，虽然 Sp Cas9 在靶标的 PAM 近端切割产生平端，但 Lb Cas12a 在 PAM 远端区域切割产生粘端；这两个特征可能解释了使用 Lb Cas12a 实现的基因靶向发生率更高 (Wolter 和 Puchta，2019)。已知在植物中起作用的三种版本的 Lb Cas12a 针对一个大麦靶标进行了测试。首先，是水稻优化的编码序列 (CDS) (Os Cas12a) (Tang et al., 2017)；其次是人类优化的 CDS (Hs Cas12a)，在双子叶植物中具有功能 (Bernabé-Orts et al., 2019)；第三是拟南芥优化的 CDS，包含 D156R“耐高温”突变 (tt At Cas12a) (Schindele and Puchta, 2020)。我们还创建了两个新版本，携带 D156R 突变的 Hs Cas12a (tt Hs Cas12a) 和携带 8 个内含子的 tt At Cas12 (tt At Cas12+int)。这些内含子之前曾显著提高过 Sp Cas9 的效率（Grutzner 2021），因此我们使用相同的在线工具（NetGene2 - 2.42 - Services - DTU Health Tech）在我们的 tt At Cas12+int 设计中为拟南芥选项获得了较高的剪接置信度。
使用crispr/ttlbcas12a用于planta基因靶向A. thaliana
CRISPR/CAS系统通过诱导特定位点DNA双链断裂（DSB）启用基因编辑。但是，诱导的修饰的性质高度取决于用于DNA DSB修复的机制。非同源末端连接（NHEJ）介导的靶向诱变是由CRISPR/CAS诱导的一种已经标准应用的工具，可以在特定的基因组位点导致各种不同种类的突变。尽管如此，使用同源供体序列的精确基因组修饰仍然具有挑战性。的应用取决于较不频繁的同源重组（HR）需要进一步改进，以创建一种有吸引力的植物应用工具。着眼于这个问题，我们开发了植物基因靶向（IPGT）系统，该系统基于同时切除稳定集成的同源供体序列和目标位点中DSB的诱导。近年来，增强了基因靶向（GT）频率的几种改进。在为IPGT链球菌CAS9（SP Cas9）和金黄色葡萄球菌Cas9（SA Cas9）成功地促进了，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。 最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。 在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。 ©2020作者。，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。©2020作者。
在Peer Rev
摘要：RNA编程的CRISPR效应蛋白CAS12A已成为基因编辑和分子诊断的强大工具。但是，需要其他生物工程策略来控制CAS12A活动。在这里，我们表明，可以使用toehold开关DNA发夹，并在环路中呈现一个合理设计的锁定的原始探针相邻基序（PAM），可用于控制CAS12A，以响应分子输入。通过链位移反应从发夹中重新配置Toehold开关DNA从发夹到双链体构象，这提供了一种有效的手段来调节PAM的可及性，从而控制了Cas12a的结合和裂解活性。通过这种方法，我们通过利用基于接近度的链位移反应来响应目标结合来展示触发下游CAS12A活性的潜力。通过利用Cas12a的反式分解活性作为信号转导方法，我们证明了我们的传感应用方法的多功能性。我们的系统可以快速地检测具有高灵敏度和特异性的IgG抗体和小分子。除了生物分析应用外，可开关的PAM设计的脚趾开关还可以作为可编程工具，能够调节基于CAS12A的靶向和DNA处理，以响应分子输入，并且对广泛的生物技术应用持希望。
CRISPR-Cas12a 系统与协同噬菌体重组蛋白在人类细胞中进行多重精确编辑
基于 CRISPR 的基因编辑技术的发展为基因组工程领域带来了一场前所未有的革命。Cas12a 是不同于 Cas9 的 2 类 V 型 CRISPR 相关核酸内切酶家族的成员，已被重新利用并开发为具有不同 PAM 识别位点和多重基因靶向能力的多功能基因编辑工具。然而，使用目前的 CRISPR/Cas12a 技术，在哺乳动物细胞中对长序列进行高效和精确的基因组编辑仍然是一项挑战。为了解决这一限制，我们利用噬菌体重组酶开发了一种高效的 CRISPR/Cas12a 工具，用于在哺乳动物细胞中进行多重精确编辑。通过蛋白质工程，我们能够将噬菌体重组蛋白招募到 Cas12a 中，以增强其同源定向修复效率。我们的噬菌体重组辅助 Cas12a 系统在不影响酶特异性的情况下，将人类细胞中千碱基级敲入的效率提高了 3 倍。该系统的性能与基因编辑任务中常用的酶 Cas9 参考相比毫不逊色，且特异性有所提高。此外，由于 Cas12a 系统的 RNA 处理活性，我们展示了具有类似改进活性的多靶点编辑。这种紧凑的多靶点编辑工具有可能帮助理解多基因相互作用。特别是，它为人类疾病的基因治疗方法铺平了道路，这种方法可以补充现有工具，适用于多基因疾病和需要长序列校正的疾病。
基于 CRISPR/Cas12a 的高效基因组编辑工具箱，用于 Methanococcus maripaludis 的代谢工程
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2022 年 3 月 16 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.12.29.474413 doi：bioRxiv preprint
基于 CRISPR-Cas 系统的微藻 Nanochloropsis oceanica 综合基因组工程工具箱
摘要：微藻可以分别利用大气中的二氧化碳和阳光作为碳源和能量来源，产生工业相关的代谢物。开发用于高通量基因组工程的分子工具可以加速产生具有改良性状的定制菌株。为此，我们开发了一种基于 Cas12a 核糖核蛋白 (RNP) 和同源定向修复 (HDR) 的基因组编辑策略，以产生微藻 Nannochloropsis oceanica 的无疤痕和无标记突变体。我们还开发了一种基于附加质粒的 Cas12a 系统，用于在目标位点有效地引入插入/缺失。此外，我们利用 Cas12a 处理相关 CRISPR 阵列的能力来执行多路复用基因组工程。我们在一次转化中有效地靶向宿主基因组中的三个位点，从而朝着微藻的高通量基因组工程迈出了重要一步。此外，还开发了一种基于 Cas9 和 Cas12a 的 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 工具，用于有效下调目标基因。我们观察到在 N. oceanica 中用 dCas9 执行 CRISPRi 后，转录水平降低了 85%。总体而言，这些发展大大加速了 N. oceanica 的基因组工程工作，并可能为改良其他微藻菌株提供通用工具箱。关键词：Nannochloropsis、微藻、基因组编辑、CRISPR-Cas、基因沉默、核糖核蛋白、Cas9、Cas12a ■ 介绍
通过裂域 CRISPR-Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，gRNA 开关可以设计为感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。