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复活的cas12a祖先扩展了对核酸编辑和检测底物的目标和识别的访问
据众所周知，RECHB是唯一描述的具有这种扩展活性的核酸酶。 div>很有可能在自然界中具有这些特征，但是在天然酶的空间中，可能会很艰巨，昂贵且需要很长时间。 div>同样，基于自动学习的计算方法仍在开始，尚无法设计具有复杂和受控功能的酶，例如大型构象变化。 div>开发了深度学习方法（OpenCrispri-1），尽管有希望，但尚未证明具有新功能设计蛋白质的能力。 div>这些限制突出了ASR生成具有多种和改进特性的复杂合成酶的能力，并开放了与深度学习和语言方法结合的新方法。 div>
预测使用机器学习靶向定位的CRISPR-CAS12A指南
通过开发CRISPR（定期间隔的短质体重复重复）的基因组编辑 - CAS技术彻底改变了生物学领域的许多领域。超过Cas9核酸酶，Cas12a（以前是CPF1）已成为CAS9编辑富含基因组的有希望的替代方法。尽管有承诺，但通过计算工具搜索指导RNA效率预测仍然缺乏准确性。通过计算元分析，我们报告说CAS12A靶标和脱靶裂解行为是核苷酸偏置的因素，相对于原始的邻接基序（PAM）相对于核苷酸不匹配。这些功能有助于训练一个随机的森林机器学习模型，以将准确性提高至少15％，而不是现有算法，以预测CAS12A酶的指导RNA效率。尽管有进展，但我们的报告强调了对更多代表性数据集的需求，并进一步进行基准测试，以可靠，准确地预测CAS12A酶的RNA效率和脱靶效应。
鉴定更高效的 AsCas12a
基因编辑是一种很有前途的新方法，可用于治疗和治愈遗传疾病。特别是，CRISPR（成簇的常规间隔回文重复序列）/Cas 已成为一种令人兴奋的治疗方式，因为它具有专门针对和修改基因组内特定位点的固有能力。用于治疗研究的两种最常见的 Cas 酶是 Cas9 和 Cas12a。Cas12a 与 Cas9 表现出重要差异，这使其成为一种令人兴奋的酶，可进一步表征为基因编辑工具。具体而言，Cas12a 识别不同的原间隔区相邻基序 (PAM)，使用较短的向导 RNA (gRNA)，并在切割位点产生粘性末端而不是平端。1,2,3,4 此外，与 Cas9 相比，Cas12a 对 R 环内错配的容忍度较低，使其成为一种更特异性的酶。5 虽然已经是一种非常特异性的酶，但最近的研究已经提高了其编辑效率，从而产生了一种称为 AsCas12a Ultra 的工程变体。 6 在这里，我们描述了最近的研究，以描述为什么 AsCas12a Ultra 比 WT AsCas12a 酶更有效，并特别强调了为什么这种新变体具有良好的治疗潜力。
一种用于识别和量化单个 CpG 甲基化位点的 CRISPR/Cas12a 辅助体外诊断工具
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/相关核酸酶 (Cas) 的优异特异性和选择性是由 CRISPR RNA (crRNA) 的可互换间隔序列以及靶序列和 crRNA 序列之间的错配位置和数量决定的。某些疾病的特征是表观遗传改变而不是核苷酸变化，因此不适合 CRISPR 辅助传感方法。在这里，我们展示了一种体外诊断工具，通过使用甲基化敏感的限制性酶 (MSRE) 然后进行 Cas12a 辅助传感来区分 DNA 中的单个 CpG 位点甲基化。非甲基化序列被 MSRE 消化，导致靶序列碎片化，从而影响 crRNA 和靶 DNA 之间的 R 环形成。我们表明，片段大小、片段位置和片段数量会影响随后对单链 DNA (ssDNA) 的附带反式切割活性，从而可以从切割活性中推断出甲基化位置。利用 MSRE 与 Cas12a 结合，可以确定癌症基因的单个 CpG 位点甲基化水平。Cas12a 和 MSRE 的模块化为 Cas12a - MSRE 组合传感方法提供了高度的多功能性，这为轻松快速地研究单个 CpG 甲基化位点以进行疾病检测提供了可能性。
Hs1Cas12a 和 Ev1Cas12a 赋予高效的基因组...
Cas12a，也称为 Cpf1，是一种用途广泛的 CRISPR-Cas 酶，已广泛应用于基因组编辑。与其众所周知的对应物 Cas9 不同，Cas12a 具有独特的功能，使其成为富含 AT 的基因组区域的高效基因组编辑工具。为了丰富 CRISPR-Cas12a 植物基因组编辑工具箱，我们探索了 17 种新的 Cas12a 直系同源物在植物中的基因组编辑能力。其中，Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 在水稻和番茄原生质体中表现出有效的多重基因组编辑。值得注意的是，Hs1Cas12a 对低温表现出更高的耐受性。此外，Hs1Cas12a 在水稻 T 0 植物中产生了高达 87.5% 的双等位基因编辑。 Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 均在杨树 T 0 植物中实现了有效编辑，尽管嵌合性较高，但高达 100% 的植物都得到了编辑。总而言之，Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 在单子叶植物和双子叶植物中表现出的高效基因组编辑凸显了它们作为植物物种及其他物种中有前途的基因组编辑工具的潜力。
CRISPR技术应用进展和优化方案
Gootenberg, JS 等人（2018 年）。“带有 Cas13、Cas12a 和 Csm6 的多路复用便携式核酸检测平台。”Science 360(6387): 439-444
通过基于 Cas12a 的 CRISPR 干扰对溶剂产气梭菌进行单基因和多基因抑制
构成梭菌属的革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧厚壁菌种具有广泛的原料消耗能力并产生增值代谢产物，但基因操作困难，限制了它们的广泛吸引力。CRISPR-Cas 系统最近已应用于梭菌种，主要使用 Cas9 作为反选择标记与基于质粒的同源重组结合。CRISPR 干扰是一种通过精确靶向核酸酶缺陷型 Cas 效应蛋白来降低特定基因表达的方法。在这里，我们开发了一种基于 dCas12a 的 CRISPR 干扰系统，用于抑制多种中温梭菌种的转录基因。我们表明，与源自其他细菌的 CRISPR Cas 系统相比，由于梭菌种中的 GC 含量低，基于新凶手弗朗西斯菌 Cas12a 的系统具有更广泛的适用性。我们证实，丙酮丁醇梭菌中靶基因的转录水平降低了 99% 以上，巴氏梭菌中靶基因的转录水平降低了 75% 以上。我们还通过使用单个合成 CRISPR 阵列证实了多重抑制，靶基因表达降低了 99%，并阐明了其表达降低的独特代谢特征。总体而言，这项工作为无需基因编辑的高通量遗传筛选奠定了基础，而基因编辑是梭菌群落当前使用的筛选方法的一个关键限制。
由 CRISPR 介导的高效靶向诱变...
CRISPR-Cas 基因组编辑技术的最新进展使得在农作物中进行定点诱变和精确基因替换成为可能。CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 是两种主要且应用广泛的基因组编辑系统。然而，当 CRISPR-Cas12a 编辑机制从转基因中表达时，一些染色体靶标在玉米和大豆等重要作物中的编辑频率较低。本文，我们报告了一种有效的方法，即通过粒子轰击将 Cas12a-gRNA 核糖核蛋白复合物 (RNP) 递送到优良玉米品种的未成熟玉米胚中，直接生成基因组编辑系。通过将 Cas12a RNP 基因枪递送到未成熟胚中，在再生过程中未经任何选择，获得了约 7% 频率的基因组编辑系。令人惊讶的是，当 Cas12a RNP 与 PMI 选择标记基因盒共同递送并用甘露糖选择诱导愈伤组织培养物时，基因编辑率平均提高到 60%，在某些实验中甚至高达 100%。我们还表明，使用活性更高的 Cas12a 突变体可提高更难处理的靶序列的编辑效率。本文描述的进展为玉米的遗传改良提供了有用的工具。
新型抗危机辅助CRISPR生物传感器，用于独家检测单链DNA（ssDNA）
摘要：核酸分析在疾病诊断和治疗中起重要作用。CRISPR技术的发现为检测核酸的检测提供了新颖而多功能的方法。但是，使用最广泛的CRISPR-CAS12A检测平台缺乏将单链DNA（ssDNA）与双链DNA（DSDNA）区分开的能力。为了克服这一局限性，我们首先采用了抗Crispr蛋白（ACRVA1）来开发一种新型的CRISPR生物传感器，以专门检测ssDNA。在这种传感策略中，ACRVA1切割CRISPR指南RNA（CRRNA）抑制CRISPR-CAS12A系统的裂解活性。只有ssDNA具有募集裂解的crRNA片段以恢复CRISPR-CAS12生物传感器的检测能力，但DSDNA无法实现这一目标。通过测量CRISPR-CAS12A生物传感器的回收裂解活性，我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器能够将ssDNA与dsDNA区分开，为检测SSDNA的检测提供了一种简单可靠的方法。此外，我们证明了我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器，以监测解旋酶的酶促活性并筛选其抑制剂。关键字：基于CRISPR的生物传感器，CAS12A（CPF1）核酸酶，抗Crispr蛋白，ACRVA1，单链DNA（SSDNA）
针对功能基因组学的工程化 CRISPR-Cas12a 的高阶组合染色质扰动
多重遗传扰动对于测试编码或非编码遗传元件之间的功能相互作用至关重要。与 DNA 切割相比，使用 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 抑制染色质形成可避免基因毒性，并且在混合检测中更有效地扰乱非编码调控元件。然而，目前的 CRISPRi 混合筛选方法通常仅限于每个细胞靶向 1-3 个基因组位点。为了开发一种在功能基因组学筛选中使用 CRISPRi 对基因组位点进行高阶 (> 3) 组合靶向的工具，我们设计了一种 Acidaminococcus Cas12a 变体——称为多重转录干扰 AsCas12a (multiAsCas12a)。 multiAsCas12a 在使用慢病毒转导传递的 CRISPR RNA（crRNA）高阶多路复用阵列进行组合 CRISPRi 靶向时，其表现明显优于最先进的 Cas12a 变体，