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World File Search SystemCAS12A
核小体和染色质对 CRISPR-Cas12a DNA 靶向的抑制
基因组工程核酸酶必须接触染色质化的 DNA。在这里，我们研究了 AsCas12a 如何切割人类核小体和相浓缩核小体阵列内的 DNA。使用定量动力学方法，我们表明动态核小体解开调节靶标对 Cas12a 的可及性，并决定核小体抑制结合的两个步骤（PAM 识别和 R 环形成）的程度。通过降低 DNA 可弯曲性、添加组蛋白修饰或引入靶标近端 dCas9 来放松核小体内的 DNA 包裹，可将 DNA 切割率提高 10 倍以上。出乎意料的是，Cas12a 很容易切割染色质状、相分离的核小体阵列内的核小体间接头 DNA。由于相邻的核小体和染色质压缩，DNA 靶向仅减少了约 5 倍。这项研究解释了核小体中的靶向切割发生频率低于细胞中核小体耗尽的基因组区域内的脱靶切割的观察结果。我们得出结论，核小体解开调节 CRISPR-Cas 核酸酶的可及性，并提出增加核小体呼吸动力学将改善真核细胞中的 DNA 靶向性。
CRISPR-CAS效应子的特异性和裂解位点确定噬菌体逃脱结果
au：PleaseconfirnheadingLevelsarerePresentedCorrected：CRISPR介导的干扰依赖于指导性CRISPR RNA（CRRNA）和靶核酸之间的互补性，以提供防御噬菌体的防御。噬菌体逃脱了基于CRISPR的免疫力，主要是通过邻接基序（PAM）和种子区域中的突变。然而，包括2类核酸内切酶Cas12a在内的CAS效应子的先前特异性研究表明，单个不匹配的耐受性很高。在噬菌体防御的背景下，尚未对这种不匹配公差的效果进行广泛的研究。在这里，我们测试了针对由Cas12a-CrrNA提供的lambda噬菌体的防御，该噬菌体含有含有先前存在的对基因组DNA中基因组靶标的不匹配。我们发现大多数先前存在的crrna不匹配导致噬菌体逃脱，无论在体外是否不匹配消融cas12a裂解。我们使用高通量测序来检查CRISPR挑战后噬菌体基因组的目标区域。在目标中的所有位置的不匹配均加速了突变噬菌体的出现，其中包括不匹配的不匹配，这些不匹配大大减慢了体外的裂解。出乎意料的是，我们的结果表明，PAM距离区域中存在的错误匹配导致目标的PAM-DISTAL区域中选择突变。体外裂解和噬菌体竞争分析表明，双Pam-Distal错误匹配比种子和Pam-Distal mis-grountes的组合要高得多，从而导致了这种选择。这些结果表明，CAS效应不匹配的耐受性，现有的靶标匹配和裂解位点强烈影响噬菌体的演变。但是，使用CAS9的类似实验并未导致PAM-DISTAL不匹配的出现，这表明切割位置的位置和随后的DNA修复可能会影响目标区域内逃生突变的位置。多种不匹配的CRRNA的表达阻止了新的突变在多个靶向位置产生，从而允许CAS12A不匹配的耐受性提供更强，更长期的protection。
下一代基因编辑工具为癌症和医学研究提供增强的能力
ONJCRI 首席执行官兼拉筹伯大学癌症医学院院长 Marco Herold 教授表示：“我们确信这项工作将鼓励其他研究团队使用这种 Cas12a 临床前模型，该模型与筛选库相结合，是一套强大的新基因编辑工具，可提高我们对许多不同癌症背后机制的理解。”
ASP 2024抽象书
成功的CRISPR/CAS介导的基因组编辑取决于在特定的DNA序列下的双链断裂（DSB）的诱导以及随后的错误修复机制的启动。但是，影响CRISPR/CASPR介导的DSB效率和维修保真度的因素在植物中仍未探索。这项研究使用Nicotiana Benthamiana探索DSB修复机制对CAS9和CAS12A酶的编辑效率的影响。测试了基因间（BUR2启动子）和外显子（RDR1）区域中的多个目标位点，以测试在体外和体内编辑中裂解的敏感性。目标部位之间的体内编辑和体外切割效率差异很大。此外，体内编辑效率没有反映体外切割效率。这些结果表明，通过DNA修复机制进行完美的重新连接会损害明显的编辑效率，这表明Indel积累可能无法准确反映CRISPR/CASPR/CAS介导的基因组编辑效率。可以成功设计在DSB修复期间量化和减少完美重新连接的工厂系统。对该系统进行的正在进行的测试表明，不同的CAS酶在DSB修复过程中具有不同级别的完美重新搭配，提供了见解，以进一步优化植物中的编辑策略。
Schindele 等人 2022 - 增强基因编辑和......
Huang, T.-K.、Armstrong, B.、Schindele, P. 和 Puchta, H. (2021) 使用 CRISPR/SaCas9 和耐高温 LbCas12a 在烟草中实现高效基因靶向。植物生物技术杂志 19 , 1314–1324。Lawrenson, T.、Hinchliffe, A.、Forner, M. 和 Harwood, W. (2022)。使用新型 Lb Cas12a 变体在大麦中进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响。 biorxiv 10.1101/2022.04.28.489853v1 Malzahn, AA, Tang, X., Lee, K., Ren, Q., Sretenovic, S., Zhang, Y., Chen, H., Kang, M., Bao, Y., Zheng, X., Deng, K., Zhang, T., Salcedo, V., Wang, K., Zhang, Y. 和 Qi, Y. (2019) 应用 CRISPR-Cas12a 温度敏感性改进水稻、玉米和拟南芥的基因组编辑。BMC 生物学 17、9。Merker, L.、Schindele, P.、Huang, T.-K.、Wolter, F. 和 Puchta, H. (2020) 使用耐温 CRISPR/LbCas12a 增强拟南芥植物体内基因靶向效率。植物生物技术杂志 18 , 2382–2384。Schindele, P. 和 Puchta, H. (2020) 改造 CRISPR/LbCas12a 以实现高效、耐高温的植物基因编辑。植物生物技术杂志 18 , 1118–1120。Weiss, T.、Crisp, PA、Rai, KM、Song, M.、Springer, NM 和 Zhang, F. (2022) 表观遗传特征极大地影响了 CRISPR-Cas9 在植物中的功效。植物生理学。
Cas9 的效率、特异性和温度敏感性...
使用 CRISPR-Cas 核糖核蛋白 (RNPs) 转染递送基因组编辑试剂比基于质粒 DNA 的递送方法具有多种优势，包括减少脱靶编辑效应、减轻非天然 DNA 片段的随机整合、不依赖载体构建以及监管限制较少。与在动物系统中的使用相比，RNP 介导的基因组编辑在植物中仍处于早期发展阶段。在本研究中，我们建立了一个高效、简化的基于原生质体的 CRISPR-Cas RNP 递送基因组编辑平台，然后评估了六种 Cas9 和 Cas12a 蛋白的效率、特异性和温度敏感性。我们的结果表明，Cas9 和 Cas12a RNP 递送在不同温度条件下（22°C、26°C 和 37°C）均导致基因组编辑频率（8.7 – 41.2%），并且没有明显的温度敏感性。 LbCas12a 通常表现出最高的活性，而 AsCas12a 表现出更高的序列特异性。CRISPR-Cas RNPs 在 22° 和 26°C（植物转化和组织培养的首选温度）下的高活性导致原生质体再生愈伤组织和在下一代恢复可遗传突变体的植物中具有高诱变效率（34.0 – 85.2%）。这种 RNP 递送方法进一步扩展到菥蓂 ( Thlaspi arvense )、大豆 ( Glycine max ) 和狗尾草，诱变频率高达 70.2%。总之，这项研究为选择 RNP 试剂以实现植物中有效的无转基因基因组编辑提供了启示。
简单的电穿孔即可在小鼠受精卵中实现高效的 CRISPR/Cas9 基因组编辑
受精卵电穿孔是小鼠中 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑中复杂的原核注射程序的快速替代方法。然而，目前的电穿孔方案要么需要投资专门的电穿孔仪，要么需要对受精卵进行腐蚀性预处理，这会损害胚胎的活力。在这里，我们描述了一种易于适应的方法，通过使用带有合成 CRISPR/Cas9 组件的普通电穿孔仪对完整的受精卵进行电穿孔，高效地在小鼠中引入特定突变，并且技术要求最低。该方案可有效处理来自各种遗传背景的受精卵，并与其他 CRISPR 核酸酶（如 Cas12a）兼容。
lbcas12a介导的棉叶卷曲的抑制作用
begomovirus具有传染性，并且严重影响了商业上重要的食物和粮食作物。棉叶卷曲的木木病毒（Clcumuv）是巴基斯坦棉花病毒最主要的特征之一，是对棉花产量的主要限制。目前，植物基因组编辑领域正在通过CRISPR/CAS系统应用（例如基础编辑，主要编辑和基于CRISPR的基因驱动器）进行革命。CRISPR/CAS9系统已成功用于模型和作物植物中的概念概念研究，以针对生物和非生物植物应力。CRISPR/CAS12和CRISPR/CAS13最近已在植物科学中应用于基础和应用研究。在这项研究中，我们使用了一种新型的方法，基于CRRNA的CAS12A工具箱，同时在多个位点靶向Clcumuv基因组的不同ORF。这种方法成功地消除了烟熏本尼亚娜和烟草的症状。从Clcumuv基因组设计了三个单独的CRRNA，针对四个不同ORF（C1，V1和C2和C3重叠区）的特定位点。基于CAS12A的构建体Cas12a-MV是通过金门三向克隆设计的，用于精确编辑Clcumuv Genome。cas12a-MV构建体是通过使用引物UBI-Intron-F1和M13-R1的整个基因组测序来确认的。通过农业纤维化方法，在4周大的尼古蒂亚纳本田植物中进行了瞬态测定。sanger测序表明，CAS12A-MV构建体在病毒基因组的靶位点上产生了相当大的突变。此外，对Sanger测序结果的潮汐分析显示了CRRNA1（21.7％），CRRNA2（24.9％）和CRRNA3（55.6％）的编辑效率。此外，Cas12a-MV构建体通过叶盘方法稳定地转化为烟草Tabacum，以评估转基因植物对Clcumuv的潜力。进行转基因分析，对烟草的转基因植物的DNA进行了PCR，以扩大具有特定底漆的Cas12a基因。传染性克隆在感染性测定中的转基因和非转基因植物（对照）中被农民接种。与具有严重症状的对照植物相比，含有Cas12a-MV的转基因植物表现出少数症状，并且保持健康。与对照植物相比，含有CAS12A-MV的转基因植物显示出病毒积累的显着降低（0.05）（1.0）。结果表明，多重LBCAS12A系统的潜在用途在模型和作物植物中针对贝诺维病毒中发展病毒抗性。
有效的CRISPR/CAS12A基于甲虫中代谢工程的基因组编辑工具箱单细胞揭示的对植物中真菌感染的细胞类型反应
。cc-by-nc 4.0国际许可证（未经同行评审证明）获得的是作者/资助者，他授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该版本的版权所有，该版本于2023年4月4日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.04.03.535386 doi：Biorxiv Preprint
通过核酸外切酶融合改进FnCas12a基因组编辑
通过外切酶融合改进 FnCas12a 基因组编辑 吴永强 1*、袁其晨 2*、朱玉峰 3、高翔 4、宋家宝 5、尹子如 6 1 河北科技大学基因编辑研究中心，河北石家庄 050018。2 美国莱斯大学化学与生物分子工程系，休斯顿，德克萨斯州 77005，美国。3 河北科技大学科技发展研究所，河北石家庄。4 河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018。5 河北科技大学生物科学与生物工程系，河北石家庄。 6 河北科技大学期刊出版社，河北石家庄 050018。 * 通讯作者：吴永强（wuyongqiang@hebust.edu.cn），袁其晨（yqc@rice.edu） 摘要 在目前报道的 Cas12a 直系同源物中，新凶手弗朗西斯菌 Cas12a (FnCas12a) 受原型间隔区相邻基序 (PAM) 的限制较少，这有助于靶向以前无法接近的基因组位点。然而，FnCas12a 核酸酶的活性相对较低或无法观察到，限制了其作为理想基因组工程工具的应用。在这里，我们描述了 TEXT（将 EXonuclease T5 与 FnCas12a 连接），这是一种融合策略，可显着提高 FnCas12a 在人类细胞中在三种不同细胞系中的多个基因组位点的敲除效率。 TEXT 在 18nt 至 23nt 不同间隔长度下均表现出比 FnCas12a 更高的插入和缺失效率，其中 18nt 的插入效率最高，比 FnCas12a 高出 11 倍。深度测序表明 TEXT 显著增加了目标位点的缺失频率和大小。总之，TEXT 增强了 FnCas12a 核酸酶的活性，拓展了其在人类细胞基因组工程中的应用。