XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemCAS12B
cas12b（A.酸性）重组
描述：重组A.酸性AAPCAS12B（V型CRISPR相关蛋白CAS12B），无标签。AAPCAS12B属于V型CRISPR效应器CRISPR-CAS12B/C2C1，对于广泛的应用，高温。物种：酸性酸性酸性构建体：CAS12B（全长）（酸性）浓度：0.20 mg/ml表达系统：大肠杆菌纯度：80％格式：水缓冲液溶液。以：50 mm磷酸钠，pH 7.5、300 mm NaCl，1 mM DTT和10％甘油MW：128 kDa GenBank登录：WP_067623834稳定性：至少在-80°C时至少6个月。存储：-80°C使用的说明：在冰上解冻，并在使用前轻轻混合。不要涡旋。在打开前进行快速旋转。等分的小容量，然后闪烁冻结以进行长期存储。避免多个冻结/解冻周期。测定条件：使用基于CRISPR的荧光记者测定法测量了不同量的AAPCAS12B活性，以获得最佳结果。使用RNA引导的DNA与CAS12结合，将靶DNA切割和不加选择的单链DNA侧支裂解激活。荧光信号的发射是由于裂解后ssDNA记者的降解所致。Active Cas12 was thawed on ice while 1X Endonuclease Buffer containing 10 mM Tris- HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , and 0.1 mg/ml BSA, guide RNA (custom designed crRNA), ds DNA activator (complementary sequence to crRNA and a PAM sequence specific for Cas enzyme) and FQ-ssDNA substrate （用荧光团和淬火器标记）平衡为室温。然后将板密封并在37°C下孵育10-30分钟。使用1X内核酸酶缓冲液制备了活性CAS12（4倍最终浓度）指南RNA（4倍最终浓度）和含有DS DNA激活剂和SSDNA报告基因（2倍最终浓度）的激活器/报告剂混合物（2倍最终浓度）。10 µL的4倍活性CAS12和10 µL的4倍引导RNA在室温下在固体黑色96井板的一半面积中预孵育10分钟。预孵育后，将20 µL的2倍激活剂/报告基因混合物添加到板上，并将其放置在振动孵化器上1分钟。然后将板平衡至室温，去除板密封剂，并在毫用读取器上读取荧光。阴性对照是通过用相等量的测定缓冲液代替酶工作溶液来测量的。应用程序：
热诱导 CRISPR/Cas12b (C2c1) 的应用......
摘要 CRISPR/Cas9 和 Cas12a (Cpf1) 工具已大规模用于基因组编辑。最近建立了一种具有单个核酸酶结构域、相对较小尺寸、低频率脱靶效应和高温下切割能力的新效应物，并将其命名为 CRISPR/Cas12b (C2c1)。Cas12b 还表现出在哺乳动物系统中的温度诱导性。因此，该系统对于编辑耐高温植物物种（如棉花）的基因组具有潜在价值。利用这种新系统，在一系列温度下通过农杆菌介导的遗传转化成功生成了陆地棉突变体。暴露在 45°C 下 4 天的转化子（被农杆菌感染的外植体）显示出最高的编辑效率。全基因组测序未检测到脱靶突变。T0 代中 AacCas12b 进行的基因组编辑忠实地传递给了 T1 代。综上所述，CRISPR/Cas12b 是一种高效、精确的棉花基因组编辑工具。
栽培禾本科植物基因组编辑的新希望
随着成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 介导的基因组编辑的出现，近年来作物改良取得了重大进展。在这种基因组编辑工具中，CRISPR 相关 Cas 核酸酶通过其首选的原间隔区相邻基序 (PAM) 限制在其 DNA 靶标上。已经开发了许多 CRISPR-Cas 变体，例如 CRISPR-Cas9、-Cas12a 和 -Cas12b，具有不同的 PAM 要求。在这篇小型评论中，我们简要介绍了用于作物改良的基于 CRISPR 的基因组编辑工具的组成部分。此外，我们力图突出介绍 CRISPR 技术的最新发展和突破，重点比较主要变体（CRISPR-Cas9、-Cas12a 和 -Cas12b）与新开发的 CRISPR-SpRY（几乎无 PAM 基因组编辑能力）。此外，我们简要介绍了 CRISPR 技术在改良栽培草类生物和非生物胁迫耐受性以及提高品质和产量方面的应用。
超紧凑型 CRISPR-Cas12j2 (CasΦ) 可实现植物的基因组编辑、基因激活和表观基因组编辑
CRISPR-Cas9、-Cas12a、-Cas12b 和 -Cas13 已被用于人类和植物细胞的基因组工程（Liu et al., 2022）。然而，这些 Cas 蛋白的尺寸较大（例如 SpCas9 为 190 kDa），难以通过病毒载体递送到细胞中。开发更小的 Cas 蛋白将导致病毒载体尺寸减小，从而可以在多功能基因组工程系统中更广泛地采用。最近，在巨型噬菌体中发现了 CRISPR-Cas12j2 (Cas F) 系统，由于 Cas12j2 的尺寸较小（80 kDa），该系统发展成为超紧凑基因组编辑器（Pausch et al., 2020）。不幸的是，使用核糖核蛋白传递的拟南芥原生质体中 Cas12j2 的基因编辑效率不到百分之一（Pausch 等人，2020 年）。如果植物科学界要采用 CRISPR-Cas12j2 介导的植物基因组编辑，显然需要进一步优化该系统。
基因编辑技术的进展
随着大核酸酶、锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas 等工具的发展，精确修改人类基因的能力已经成为可能。这些技术现在使得产生靶向缺失、插入、基因敲除和点变异成为可能；通过将转录因子或表观遗传机制靶向 DNA 来调节基因表达；或靶向和修改 RNA。内源性修复机制用于对 DNA 进行所需的修改；它们包括非同源末端连接、同源性定向修复、同源性独立的靶向整合、微同源性介导的末端连接、碱基切除修复和错配修复。可以使用计算机预测和测序来监测脱靶效应，并使用具有更高精度的 Cas 蛋白（例如高保真度 Cas9、增强特异性 Cas9 和超精确 Cas9）将其最小化。已发现 Cas9 的替代品，包括 Cpf1、Cas12a、Cas12b 和较小的 Cas9 直系同源物（如 CjCas9）。基因编辑成分的递送是使用标准技术在体外进行，或使用 AAV、脂质纳米颗粒或细胞穿透肽在体内进行。基因编辑技术的临床开发正在多个领域取得进展，包括癌症治疗中的免疫疗法、HIV 感染的抗病毒疗法以及治疗遗传性疾病，如 b 地中海贫血、镰状细胞病、溶酶体贮积症和视网膜营养不良症。我们在此回顾这些技术进步及其临床实施面临的挑战。
利用多种 V 型 CRISPR 进行无 PAM 诊断
V 型 CRISPR-Cas 效应子通过促进核酸生物标志物的检测，彻底改变了分子诊断。然而，它们依赖于目标双链 DNA (dsDNA) 上原间隔区相邻基序 (PAM) 位点的存在，这极大地限制了它们作为诊断工具的灵活性。在这里，我们提出了一种名为 PICNIC 的新方法，该方法只需对当代 CRISPR 检测方案进行约 10 分钟的简单修改，即可解决基于 CRISPR 的诊断的 PAM 问题。我们的方法包括通过高温和高 pH 处理将 dsDNA 分离成单个单链 DNA (ssDNA) 链。然后，我们以无 PAM 的方式使用多种 Cas12 酶检测释放的 ssDNA 链。我们通过成功将 PICNIC 用于 Cas12 家族的三种不同亚型（Cas12a、Cas12b 和 Cas12i）的无 PAM 检测，展示了 PICNIC 的实用性。值得注意的是，通过将 PICNIC 与含有 crRNA 的截短 15 核苷酸间隔区相结合，我们证明了使用 CRISPR 进行临床上重要的单核苷酸多态性的 PAM 独立检测。我们采用这种方法检测 HIV-1 的耐药变体（特别是 K103N 突变体）的存在，该变体在突变附近缺乏 PAM 位点。此外，我们成功地将我们的方法应用于临床样本，通过在 HCV 基因组中无 PAM 位点以 100% 特异性检测和基因分型 HCV-1a 和 HCV-1b 变体。总之，PICNIC 是一种简单但具有突破性的方法，它通过消除 PAM 序列的限制提高了基于 CRISPR-Cas12 的诊断的灵活性和精确度。
CriSNPr，一种使用多种 Cas 系统对 CRISPR 诊断的 gRNA 进行精选和从头设计的单一界面
摘要 基于 CRISPR 的诊断技术 (CRISPRDx) 通过检测核酸和识别变异体改善了临床决策，尤其是在 COVID-19 大流行期间。新型和工程化的 CRISPR 效应子的发现加速了这一进程，它们扩大了诊断应用的范围，涵盖了广泛的致病和非致病条件。然而，每个诊断 CRISPR 流程都需要根据所用 Cas 蛋白的基本原理、其向导 RNA (gRNA) 设计参数和检测读数定制检测方案。这对于变异检测尤其重要，变异检测是基于测序方法的低成本替代方法，目前尚无用于 CRISPRDx 即用型设计的计算机模拟流程。在本文中，我们使用统一的 Web 服务器 CriSNPr（基于 CRISPR 的 SNP 识别）填补了这一空白，它为用户提供了基于六种 CRISPRDx 蛋白（Fn /en Fn Cas9、Lw Cas13a、Lb Cas12a、Aa Cas12b 和 Cas14a）从头设计 gRNA 的机会，并查询可用于验证相关样本的即用型寡核苷酸序列。此外，我们还提供了一个精选的预先设计的 gRNA 数据库以及迄今为止报告的所有人类和 SARS-CoV-2 变体的靶标/脱靶数据库。CriSNPr 已在多种 Cas 蛋白上得到验证，证明了其在多个检测平台上广泛且直接的适用性。CriSNPr 可在 http://crisnpr.igib.res.in/ 找到。
利用甘蔗 CRISPR/Cas9 技术对非栽培草类进行遗传改良
在不断变化的气候情景下，草原保护和发展已成为赋予其生态系统服务功能可持续性的当务之急。通过有针对性地对本地草种进行基因改良，可以有效实现这些目标。据我们所知，关于在天然和半天然草原中普遍存在的非栽培草种（柳枝稷、野生甘蔗、草原大麦、狗牙根草、中国银草等）的基因编辑的研究成果非常少。因此，为了探索这一新颖的研究方面，本研究旨在将用于改良栽培草类尤其是甘蔗的基因编辑技术也用于非栽培草类。我们建议将甘蔗作为非栽培草类基因改良的典型作物的假设是，与其他栽培草类（水稻、小麦、大麦、玉米等）相比，甘蔗的多倍体和非整倍体导致基因编辑的复杂性。另一个原因是，考虑到高度的遗传冗余，已经开发和优化了甘蔗（x = 10 – 13）的基因组编辑方案。因此，据我们所知，本综述是第一项客观评估 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）/Cas9 技术在甘蔗中的概念和功能的研究，评估其高度多功能性、目标特异性、效率、设计简单性和多路复用能力，以探索针对生物和非生物胁迫对非栽培禾本科植物进行基因编辑的新研究视角。此外，甘蔗基因编辑面临的巨大挑战导致了 CRISPR 工具的不同变体（Cas9、Cas12a、Cas12b 和 SpRY）的开发，其技术性也得到了严格评估。此外，还强调了该技术在非栽培禾本科植物基因编辑过程中可能出现的不同局限性。
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。