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具有单核苷酸的高保真DNAZYME辅助CRISPR/CAS13A系统解决特异性
有两种改善特定城市Cas12a和Cas13a核酸酶的常用方法。是工程师CRRNA，包括将合成不匹配引入crrna的间隔域，设计发夹 - 间隔者CRRNA，以及用2 0 -O -methyl修改CRRNA。21 - 25然而，必须仔细设计不匹配的CRRNA中的数量和位置，以减少无靶标的效果，而无需牺牲CAS蛋白的裂解活性。22,23更重要的是，使用发夹蛋白 - 间隔者CRRNA和2 0-O-methyl modi crrna仅将原始CRISPR/CAS系统的特定城市提高了2至3倍。24,25另一种方法是高级工程cas蛋白。26 - 28，由于复杂的蛋白质表达和筛选过程，它仍然与之合作。此外，所有这些策略旨在优化CRISPR/CAS系统的不同组成部分，而无需克服裂解效率和特定城市之间的基本交易。因此，可以显着改善特定城市的策略对于它们的实际应用（例如生物传感）非常需要，因为它们将避免误解积极的结果。dnazymes（也称为脱氧核酶，DNA酶或催化DNA），是单链DNA分子，具有
2020；8：30-36。doi：10.7150/jgen.43928 研究论文利用 Cas13a 进行可编程 CRISPR 干扰，实现蚊子基因沉默
在 CRISPR-Cas 系统中，Cas13a 是一种 RNA 引导的 RNA 核酸酶，专门靶向单链 RNA。我们开发了一种 Cas13a 介导的 CRISPR 干扰工具，以靶向 mRNA 来实现蚊子的基因沉默。通过胸内注射将表达 Cas13a 的质粒递送给蚊子，递送后至少 10 天仍可检测到 Cas13a 转录本。使用 T7 RNA 聚合酶在体外合成靶向特异性 crRNA。Cas13a 质粒和靶向 crRNA 可以通过胸内注射一起递送，或者可以先提供 Cas13a 构建体，然后在适当的时候提供靶向 crRNA。在两种蚊子中测试了该机制。在冈比亚按蚊中，卵黄蛋白基因被 Cas13a/Vg-crRNA 沉默，同时伴有产卵量显著下降。在埃及伊蚊中，COPI 基因的 α 和 δ 亚基被 Cas13a/crRNA 沉默，导致死亡和中肠脆弱，重现了之前报道的表型。当提供目标 crRNA 混合物时，可以同时实现基因共沉默。研究中未观察到非目标转录本的可检测的附带切割。除了 dsRNA 或 siRNA 介导的 RNA 干扰外，可编程的 CRISPR 干扰方法提供了一种在蚊子中敲除基因的替代方法。
简介及应用
为Ҷ进一步ՈॆCas13a ⭘于RNA ࠶ᆀ䇺ᯝ的⚥ᓖ，ᕐ䬻઼ -aPes -CROOLQs 䈮仈㓴合ሶ䟽㓴㚊合䞦ᢙ໎ᢰᵟ˄recRPELQase pRO\Perse aPpOLILcaWLRQ，RPA˅઼Cas13a 的旁支活性结合，ᔰ发 ࠪҶާᴹᴤ侩⚥ᓖ的'NARNA ࠶ᆀỰ⍻ᐕާüüS+(R/2C.˄SpecLILc +LJK-SeQsLWLYLW\ (Q]\PaWLc RepRrWer 8Q/2C.LQJ˅。俆ݸ࡙⭘RPA 或R7-RPA ሶṧ૱中的Ṩ䞨࠶ᆀ序列进㹼ᚂᢙ໎，❦ਾ㓿7 䖜ᖅ䞦 䖜ᖅࠪབྷ䟿的RNA ࠶ᆀ，ަ中的目标RNA ࠶ᆀ与crRNA-Cas13 ༽合⢙ 结合◰活Cas13 㳻ⲭ的旁支活性，从而切割ઘത⧟ຳ中࣐的ᣕ࠶ ᆀ，ӗ⭏㜭被Ự⍻的㦗ݹؑਧ。
广谱 CRISPR-Cas13a 可实现高效的噬菌体基因组编辑
CRISPR-Cas13 蛋白是 RNA 引导的 RNA 核酸酶，通过与互补的靶噬菌体转录本结合，然后进行一般的非特异性 RNA 降解，来防御入侵的 RNA 和 DNA 噬菌体。在这里，我们分析了 Leptotrichia buccalis 的 LbuCas13a 的防御能力，发现它具有强大的抗病毒活性，不受靶噬菌体基因的必要性、基因表达时间或靶序列位置的影响。此外，我们发现 LbuCas13a 的抗病毒活性对各种噬菌体具有广泛效果，方法是将 LbuCas13a 与来自不同系统发育群的九种大肠杆菌噬菌体进行对抗。利用 LbuCas13a 靶向的多功能性和效力，我们将 LbuCas13a 应用于广谱噬菌体编辑。使用两步噬菌体编辑和富集方法，我们在三种不同的噬菌体中实现了七次无标记基因组编辑，效率高达 100%，包括多基因删除和替换单个密码子等编辑。Cas13a 可用作编辑地球上最丰富、最多样化的生物实体的通用工具。
spycas9的核仁定位会影响其稳定性，并干扰哺乳动物细胞中宿主蛋白的翻译
巨型噬菌体（例如铜绿假单胞菌）具有抗菌剂的潜力，也是揭示基本噬菌体生物学的模型。目前，由于蛋白质的“噬菌体核”结构，这两种追求都受到缺乏基因工程工具的限制，该结构可保护DNA靶向DNA靶向CRISPR-CAS工具。为了提供用于DNA巨型噬菌体的逆转苯二酚工具，我们将同源重组与靶向RNA的CRISPR-CAS13A酶相结合，并使用了抗Crispr基因（ACRVIA1）作为可选标记。我们表明，此过程可以插入外源基因，删除基因并为μkz基因组添加荧光标签。内源性GP93的荧光标记表明，它是用噬菌体DNA弹出的，而小管蛋白样蛋白phuz的缺失令人惊讶地对噬菌体爆发尺寸产生了适中的影响。还实现了抗DNA靶向CRISPR-CAS系统的另外两个噬菌体的编辑。靶向RNA CAS13A具有成为一种通用遗传编辑工具的巨大前景，可以实现对未知功能的噬菌体基因的系统研究。
利用 CRISPR-Cas13a 进行噬菌体基因组工程
巨型噬菌体（例如铜绿假单胞菌 Ф KZ）具有作为抗菌剂和揭示基本噬菌体生物学模型的潜力。由于蛋白质“噬菌体核”结构可防止 DNA 靶向 CRISPR-Cas 工具的攻击，目前这两种研究都因缺乏基因工程工具而受到限制。为了为 DNA 巨型噬菌体提供反向遗传学工具，我们将同源重组与 RNA 靶向 CRISPR-Cas13a 酶相结合，并使用抗 CRISPR 基因 (acrVIA1) 作为可选择标记。我们表明，该过程可以插入外来基因、删除基因并向 Ф KZ 基因组添加荧光标签。内源性 gp93 的荧光标记显示它会随噬菌体 DNA 一起排出，而微管蛋白样蛋白 PhuZ 的缺失令人惊讶地对噬菌体爆发大小的影响很小。还成功编辑了另外两种能够抵抗 DNA 靶向 CRISPR-Cas 系统的噬菌体。RNA 靶向 Cas13a 有望成为难治性噬菌体的通用基因编辑工具，从而能够系统地研究功能未知的噬菌体基因。
CRISPR-Cas13a系统的应用进展
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白是一种适应性免疫系统，可保护原核生物和一些感染原核生物的病毒免受外来核酸（如病毒和质粒）的侵害。大多数古细菌和大约一半的细菌的基因组都含有各种 CRISPR-Cas 系统。CRISPR-Cas 系统依赖于 CRISPR RNA (crRNA)。它们充当导航系统，通过识别入侵的外来核酸并结合 Cas 蛋白来特异性地切割和破坏外来核酸。在本综述中，我们简要概述了 CRISPR-Cas 系统的进化和分类，重点介绍了 CRISPR-Cas13a 系统的功能和应用。我们描述了 CRISPR-Cas13a 系统并讨论了其 RNA 指导的核糖核酸酶功能。同时，我们简要介绍了CRISPR-Cas13a系统的作用机制，并总结了CRISPR-Cas13a系统在病原体检测、真核生物、农业、生物传感器和人类基因治疗中的应用。我们对CRISPR-Cas13a的正确理解已经得到拓宽，CRISPR-Cas13a系统将有助于开发新的RNA靶向工具。因此，了解CRISPR-Cas13a效应蛋白的结构、功能和生物学特性的基本细节对于优化RNA靶向工具至关重要。
基于CRISPR-CAS13A系统，为禽流感病毒建立快速的视觉检测方法
迅速，特定且敏感地检测禽流感病毒（AIV），这项研究建立了一种基于定期群散布的短palindromic重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白13A（Cas13a）的重组酶辅助扩增（RAA）的视觉检测方法。在这项研究中，根据AIV核蛋白（NP）基因的保守序列设计了特定的引物和CRRNA RNA（CRRNA）。raa技术用于放大目标序列，并通过侧流量尺（LFD）视觉检测到放大产物。评估了Raa-Crispr-Cas13a-lfd的特定峰，敏感性和可重复性。同时，使用该方法和聚合酶链反应（PCR） - 琼脂糖电泳方法检测临床样品，并计算了两种检测方法的重合速率。结果表明，RAA-CRISPR-CAS13A-LFD方法可以实现目标基因片段的特定扩增，并且可以通过LFD视觉观察到检测结果。同时，与感染性支气管炎病毒（IBV），传染性喉咙痛病毒（ILTV）和纽卡斯尔病毒病毒（NDV）没有交叉反应。灵敏度达到10 0拷贝/ µL，比PCR-琼脂糖电泳方法高1,000倍。临床测试的巧合率为98.75％，总反应时间约为1小时。在这项研究中建立的RAA-CRISPR-CAS13A-LFD方法具有快速，简单，强大的特异性和高灵敏度的优点，这为AIV检测提供了新的视觉方法。
CriSNPr，一种使用多种 Cas 系统对 CRISPR 诊断的 gRNA 进行精选和从头设计的单一界面
摘要 基于 CRISPR 的诊断技术 (CRISPRDx) 通过检测核酸和识别变异体改善了临床决策，尤其是在 COVID-19 大流行期间。新型和工程化的 CRISPR 效应子的发现加速了这一进程，它们扩大了诊断应用的范围，涵盖了广泛的致病和非致病条件。然而，每个诊断 CRISPR 流程都需要根据所用 Cas 蛋白的基本原理、其向导 RNA (gRNA) 设计参数和检测读数定制检测方案。这对于变异检测尤其重要，变异检测是基于测序方法的低成本替代方法，目前尚无用于 CRISPRDx 即用型设计的计算机模拟流程。在本文中，我们使用统一的 Web 服务器 CriSNPr（基于 CRISPR 的 SNP 识别）填补了这一空白，它为用户提供了基于六种 CRISPRDx 蛋白（Fn /en Fn Cas9、Lw Cas13a、Lb Cas12a、Aa Cas12b 和 Cas14a）从头设计 gRNA 的机会，并查询可用于验证相关样本的即用型寡核苷酸序列。此外，我们还提供了一个精选的预先设计的 gRNA 数据库以及迄今为止报告的所有人类和 SARS-CoV-2 变体的靶标/脱靶数据库。CriSNPr 已在多种 Cas 蛋白上得到验证，证明了其在多个检测平台上广泛且直接的适用性。CriSNPr 可在 http://crisnpr.igib.res.in/ 找到。
CRISPR系统在灵敏核苷酸检测中的拓展开发与应用
CRISPR/Cas 系统最初是作为基因编辑工具开发的，在核苷酸检测方面也显示出巨大的潜力。最近发表在 Molecular Cell 上的一项研究（Freije et al., 2019）开发了一种基于 Cas13a 的 CARVER（Cas13 辅助限制病毒表达和读取）来检测 RNA 病毒，例如淋巴细胞脉络丛脑膜炎、甲型流感和水泡性口炎，这为在疾病诊断中检测广泛的病毒核苷酸提供了潜在的扩展应用。细菌和古细菌利用 CRISPR/Cas（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关）系统作为适应性免疫系统来防御噬菌体感染。 Cas效应子在CRISPR RNA（crRNA）的引导下，结合并切割DNA或RNA靶标，以防御入侵的核苷酸（Horvath and Barrangou，2010；Sorek et al.，2013；Barrangou and Marafini，2014）。CRISPR/Cas系统的发现可以追溯到1987年，规则间隔的直向重复序列首次在大肠杆菌的iap基因中发现（Ishino et al.，1987）。直到2002年，间隔直向重复序列被命名为CRISPR（Jansen et al.，2002）。2012年，Jinek et al.报道称，CRISPR/Cas9 可以用单个 RNA 嵌合体特异性切割靶 DNA（Jinek 等，2012），拉开了 CRISPR/Cas9 系统用于基因组编辑的序幕。自 CRISPR/Cas9 被发现以来，CRISPR/Cas 系统备受关注，CRISPR 工具箱不断扩充。作为 DNA 靶向 CRISPR 工具箱的有力补充，CRISPR/Cas12a（以前称为 CpfI）是一种 2 类 V 型 CRISPR/Cas 效应物（Zetsche 等，2015），具有