C9ORF72基因中的GGGGCC 24+六核苷酸重复膨胀(HRE)是肌萎缩性侧向硬化症(ALS)和额颞痴呆(FTD)最常见的遗传学原因(ALS),致命的神经退行性疾病,没有治疗或不接受疾病的疾病疾病的疾病降低或不得已。神经元死亡的机械基础包括C9orf72单倍依耐酸,核中RNA结合蛋白的隔离以及二肽重复蛋白的产生。在这里,我们使用了腺相关的病毒载体系统来提供CRISPR/CAS9基因编辑机构,以实现从C9ORF72基因组基因座中移除HRE。我们证明了三种含有膨胀的小鼠模型(500 - 600重复)以及患者来源的IPSC运动神经元和脑类动物(450重复)的三种小鼠模型(450个重复)中HRE的成功切除。这导致了RNA焦点,多二肽和单倍耐酸的降低,这是C9-ALS/FTD的主要标志,这使得这是这些疾病的有前途的治疗方法。
crispr是生物技术中的开创性技术,它改变了我们看待基因编辑的方式。通过实现DNA的精确变化,CRISPR可以为新疗法打开门,改善农作物等等。同时,管理道德和安全挑战以确保对技术的负责任使用。
HK-CRISPR-CAP-H-MEGFP细胞系是一种为晚期基因编辑和荧光应用而设计的人类衍生模型。该细胞系基于亲本人类细胞系,并已使用CRISPR-CAS9技术进行了修改,以表达用单体增强的绿色荧光蛋白(MEGFP)标记的CAP-H(染色体相关蛋白H)基因。这种修饰允许CAP-H的精确可视化和跟踪,CAP-H是冷凝蛋白复合物的组成部分,对于细胞分裂期间的染色体凝结和稳定至关重要。MEGFP标签提供了强烈而稳定的荧光信号,这使该细胞系非常适合活细胞成像和基于荧光的测定。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
由于融合蛋白NUP96-MEGFP的稳定表达而选择了该特定的克隆,并选择了数字195,并保留了U-2 OS系的典型特征,包括固体细胞骨架结构,这对于与癌细胞和转移的迁移有关的研究至关重要。使用CRISPR技术可确保基因的精确版本,从而最大程度地减少可能威胁实验结果完整性的脱靶效应。这意味着U-2 OS-Crispr-NUP96-MEGFP 195克隆在高分辨率成像技术和详细的细胞结构中特别有用,有助于细胞生物学,癌症研究和核转运现象的先进研究。
通过促进荧光配体或其他探针的共价钩,Halotag允许实时成像,并为研究活细胞中的核转运机制提供了强大的工具。该特定的克隆(数字252)是为其稳定表达的NUP96的稳定表达而选择的,该表达可确保实验配置中的持续性能。此功能使其非常适合高分辨率成像技术和分子相互作用研究,从而支持细胞生物学的先进研究,特别是在核功能和遗传调节的背景下。
亚培养从相邻的细胞中去除旧培养基,并将其洗净,而PBS不含钙和镁。对于T25烧瓶,使用3-5 mL PBS,对于T75烧瓶5-10 ml。然后,使用1-2 mL对T25和2.5 ml平底物完全覆盖Accutase细胞,用于T75烧瓶。让细胞在室温下持续8-10分钟,将它们分开。孵育后,将细胞与10 mL培养基轻轻混合以再次悬挂,然后以300xg的速度将其提起3分钟。拒绝上清液,再次将细胞挂在新鲜的培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
在U-2 OS-Crispr-Nup96-SNAP 33中,在基因座NUP96中的SNAP标记的整合允许荧光底物或其他化学探针的特定且共价连接,这些探针可用于想象活细胞和其他生化测试。此功能使其成为测试核质转运的分子动力学的宝贵工具,对与NPC相关的病理学的理解以及筛选影响NPC功能的治疗化合物。细胞系还保留了U-2 OS母系的特征,包括高水平的遗传稳定性和易于繁殖的易变,这要归功于它适合于高性能筛查和细胞生物学的扩展测试。
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LIFT-CM POCT分析系统,其中包括一个加热平台,离心模块和实时荧光检测。它是紧凑的,易于使用的,并且由智能手机应用程序控制,从而减少了对多个实验室仪器的需求。这使CRISPR-DX技术在资源有限的设置中更加实用。