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CRISPR/DCAS9工具包用于玉米基因的功能分析
确实有效。使用基于DCAS9（PDA2），DCAS9-VP64（PDA3）或DCAS9-SRDX（PDA4）载体的CRISPRA/CRISPRI原生质体系统，我们测试了前四个GRNA候选者的有效性，靶向PDS1，CHLH和TRXH和TRXH，FICE（FICE）和3和TRXH，FICE（FICE）和3（FICE）2及3次。与其他关于DCAS9活性的报道类似，我们观察到PDA2在CHLH表达上表现出一些抑制活性（图3A），尽管对于某些GRNA，PDA4的幅度较大（图3B）。用PDA3（CRISPRA构建体）测试，表明TRXH表达增加了两倍，具体取决于GRNA共转染了哪个GRNA（图3C）。这项研究中观察到的GRNA之间的有效性不同，重申了测试多个候选物的必要性。
胰腺癌中 ANGPTL4 过表达的转录组学和功能分析提名逆转化学耐药性的靶点
ANGPTL4 有助于患者生存，特别是它如何通过可能在耐药性中发挥作用来改变生存结果。我们使用 CRISPRa (MP2_ANGPTL4_OE) [21] 和 siRNA 敲低 (MP2_ANGPTL4_KD) 测量了 ANGPTL4 在 MIA PaCa-2 细胞系中过表达和敲低的影响。qPCR 显示，与非靶向对照向导相比，CRISPRa 成功地将 ANGPTL4 转录物的表达提高了 8 倍。同样，siRNA 敲低使对照系的表达降低了 90% 以上（图 1B，补充表 S1）。蛋白质水平受到类似影响（补充图 S1B）。我们使用 RNA 测序测量了修饰细胞系和对照的全局基因表达变化，结果显示 1198 个差异表达基因 (DEG) 符合以下标准：它们的平均读取数大于 10，绝对 log 2 倍变化 (log2FC) 至少
用于基因敲除和转录调控的 PAM 柔性 Cas9 变体的高通量筛选
1. 纽约基因组中心，纽约，纽约州，美国 2. 纽约大学生物学系，纽约，纽约州，美国 3. 这些作者贡献相同 * 电子邮件：neville@sanjanalab.org 关键词：Cas9、诱变、汇集 CRISPR 筛选、CRISPRa、CRISPRi、原间隔区相邻基序
循环，与条件无关的活性在一级运动皮层中预测矫正运动行为
不同细胞群体的位点特异性遗传和表观遗传靶向是分子神经科学的核心目标，对于理解基因调节机制至关重要，这些基因调节机制是基于复杂的表型和行为的基础。虽然最近的技术进步已经实现了对基因表达的前所未有的控制，但其中许多方法都集中在选定的模型生物上和/或需要针对不同应用的劳动密集型定制。群集定期插入短质体重复序列（基于CRISPR）的系统的简单性和模块化已改变了基因组编辑并扩展了基因调节工具箱。但是，几乎没有可用于神经元细胞选择性CRISPR调节的工具。我们设计，验证和优化的CRISPR激活（CRISPRA）和CRISPR干扰（CRISPRI）系统用于CRE重组酶依赖性基因调节。出乎意料的是，基于传统的双流传式开放阅读框（DIO）策略的CRISPRA系统即使没有CRE也会显示出漏水的靶基因诱导。因此，我们开发了一种含有内含子的CRE依赖性CRISPRA系统（SVI-DIO-DCAS9-VPR），该系统减轻了泄漏基因诱导，并在HEK293T细胞和大鼠原发性神经元培养物中的内源基因上的传统DIO系统表现优于传统的DIO系统。使用基因特异性CRISPR SGRNA，我们证明了SVI-DIO-DCAS9-VPR可以以CRE特异性方式激活许多大鼠或人类基因（GRM2，TENT5B，FOS，SSTR2和GADD45B）。为了说明该工具的多功能性，我们创建了一个平行的CRISPRI构建体，该构建体仅在CRE存在下仅在HEK293T细胞中成功抑制了荧光素酶报告器的表达。这些结果为跨不同模型系统的CRE依赖性CRISPR-DCAS9方法提供了强大的框架，并在与常见的CRE驱动线或通过病毒载体交付时实现了细胞特异性靶向。
依赖 Cre 的 CRISPR/dCas9 系统用于调控神经元的基因表达
对不同细胞群体进行位点特异性遗传和表观遗传靶向是分子神经科学的核心目标，对于理解复杂表型和行为背后的基因调控机制至关重要。虽然最近的技术进步使对基因表达的控制达到了前所未有的程度，但其中许多方法都集中在选定的模型生物上和/或需要针对不同应用进行劳动密集型定制。基于 CRISPR 的系统的简单性和模块化已经改变了基因组编辑的这一方面，提供了各种可能的应用和目标。然而，目前很少有可用于神经元中细胞选择性 CRISPR 调控的工具。在这里，我们设计、验证和优化了 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 系统，以实现 Cre 重组酶依赖性基因调控。出乎意料的是，基于传统双链倒置开放阅读框 (DIO) 策略的 CRISPRa 系统在没有 Cre 的情况下表现出泄漏的靶基因诱导。因此，我们开发了一种内含子 Cre 依赖性 CRISPRa 系统 (SVI-DIO-dCas9-VPR)，该系统可缓解泄漏基因诱导，并且在 HEK293T 细胞和大鼠原代神经元培养物中，其在内源基因方面的表现均优于传统 DIO 系统。使用基因特异性 CRISPR sgRNA，我们证明 SVI-DIO-dCas9-VPR 可以以 Cre 特异性方式激活高度可诱导基因 (GRM2、Tent5b 和 Fos) 以及中等可诱导基因 (Sstr2 和 Gadd45b)。此外，为了说明此工具的多功能性，我们创建了一个平行的 CRISPRi 构建体，仅在存在 Cre 的情况下，它才成功抑制了 HEK293T 细胞中荧光素酶报告基因的表达。这些结果为不同模型系统中的 Cre 依赖性 CRISPR-dCas9 方法提供了一个强大的框架，并且当与常见的 Cre 驱动线或通过病毒载体进行 Cre 递送相结合时，将实现细胞特异性靶向。
用于（表观）基因组编辑和基因治疗的 mRNA 反式剪接双 AAV 载体
大基因包括几个 CRISPR-Cas 模块，如基因激活剂 (CRISPRa)，需要双腺相关病毒 (AAV) 载体才能有效地在体内传递和表达。当前的双 AAV 载体方法具有重要的局限性，例如重建效率低、产生外来蛋白质或分裂位点选择的灵活性低。在这里，我们介绍了一种基于通过 mRNA 反式剪接 (REVeRT) 重建的双 AAV 载体技术。REVeRT 在分裂位点选择方面具有灵活性，可以在多种体外模型、人类类器官和体内有效地重建不同的分裂基因。此外，REVeRT 可以通过单一或多重方法在不同的给药途径上功能性地重建针对各种小鼠组织和器官中基因的 CRISPRa 模块。最后，REVeRT 能够在 Stargardt 病小鼠模型中玻璃体内注射后重建全长 ABCA4。由于其灵活性和效率，REVeRT 在基础研究和临床应用方面具有巨大潜力。
通过优化SGRNA ...
摘要aflysam/crispra系统最近已成为果蝇果蝇（Drosophila Melanogaster）的功能性研究的强大工具。该系统包括GAL4/UAS驱动的DCAS9激活剂和U6促进器控制的SGRNA。建立了超过其他组合的DCAS9激活剂，以进一步提高靶向激活剂的效率，我们系统地优化了SGRNA的参数。有趣的是，发现最有效的SGRNA在转录起始位点（TSS）上游的-150bp到-450bp的区域积累，并且激活效率显示与SGRNA靶向序列的GC含量的正阳性相关性很强。此外，目标区域主要是GC含量，因为SGRNA的靶向区域超过-600BP，即使含有75％的GC，TSS的SGRNA都会降低效率。令人惊讶的是，当将靶向sgrNA的活性与DNA链的活性进行比较时，靶向非模板链的SGRNA靶向均优于互补的模板链，无论是在细胞和体内。总而言之，我们定义了SGRNA设计的标准，这将极大地促进CRISPRA在功能奖励研究中的应用。
基于CRISPR的功能基因组学用于神经系统疾病 在双向脑计算机界面中，升华和无效的投影作为伪影刺激的伪影抑制方法
神经退行性，神经发育和神经精神疾病是最大的公共卫生挑战之一，因为许多人缺乏调整疾病的治疗方法。缺乏有效疗法的主要原因是我们对病因和细胞机制的有限理解。全基因组关联研究正在提供越来越多的疾病相关遗传变异的目录。下一个挑战是阐明这些变体如何引起疾病，并将这种理解转化为疗法。本综述描述了最近开发的基于CRISPR的功能基因组学方法如何发现神经系统疾病中的疾病机制和治疗靶标。使用CRISPR干扰（CRISPRI）和CRISPR激活（CRISPRA），可在实验疾病模型中使用细菌CRISPR系统来编辑基因组并控制基因的表达水平。这些遗传扰动可以在大规模平行的遗传筛选中实施，以评估人类细胞的功能后果。CRISPR筛选与诱导的多能干细胞（IPSC）技术相结合，该技术能够推导分化的细胞类型，例如神经元和神经胶质，以及来自从患者获得的细胞的脑器官。基于疾病相关的基因表达变化的基于CRISPRI/CRISPRA的建模可以确定因果变化。遗传修饰者筛查可以阐明疾病机制，细胞类型选择性脆弱性的因果决定因素，并确定治疗靶标。
遗传学
Cas，CRISPR 相关；CRISPR，成簇的规律间隔的短回文重复序列；CRISPRa，CRISPR 介导的转录激活；CRISPRi，CRISPR 介导的转录抑制；crRNA，CRISPR RNA；crRNP，CRISPR 核糖核蛋白；dCas9，核酸酶失活 Cas9；DSB，双链断裂；dsDNA，双链 DNA；dsODN，双链寡脱氧核苷酸；gRNA，向导 RNA；H3K27ac，组蛋白 H3 赖氨酸 27 乙酰化；H3K4me1，组蛋白 H3 赖氨酸 4 单甲基化；LAM-PCR，线性扩增介导的 PCR；LSD1，赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶 1；MCP，MS2 外壳蛋白；MOI，感染复数； p65AD，核因子-κB反式激活亚基激活结构域；PAM，原型间隔区相邻基序；RNAi，RNA干扰；scFV，单链可变片段；sfGFP，超折叠GFP；sgRNA，单向导RNA；ssRNA，单链RNA。
标题：下一代机器人应用程序的5G和基础AI模型发言人：Bharadwaj Amrutur摘要：生成AI，尤其是LA
模块5基因组编辑方法1 [6小时]转基因，CRE-LOXP，PHIC31-积聚酶和MOS1- Transposon的位点特异性染色体整合。模块6基因组编辑方法2 [6小时]带有Talens和ZFN的基因组工程。CRISPR-CAS9冥想基因组编辑的发现和机制。不同的CRISPR系统及其在基因组编辑中的用途。模块7 [3小时] SGRNA和修复模板的设计。下一代克隆技术。模型生物体的基因组工程方法。使用秀丽隐杆线虫模型有机体构建转基因和敲除。模块8 CRISPR介导的基因组编辑的应用[6小时] CAS9用于基因调节：CRISPR干扰（CRISPRI），CRISPR激活（CRISPRA）和CRISPRON。全基因组CRISPR敲除屏幕。在农业，食品和燃料行业中的应用。CRISPR对基因组编辑的道德问题。教科书