XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemCRISPRi
tgCRISPRi：使用截短的 gRNA 和催化活性 Cas9 进行有效的基因敲除
CRISPR 干扰 (CRISPRi) 是一种在哺乳动物细胞中沉默基因的高效方法，它采用酶失活形式的 Cas9 (dCas9) 与一个或多个与靶基因转录起始位点互补 20 个核苷酸 (nt) 的向导 RNA (gRNA) 复合。此类 gRNA/dCas9 复合物与 DNA 结合，阻碍目标基因座的转录。在这里，我们提出了一种替代的基因抑制策略，即使用活性 Cas9 与截短的 gRNA (tgRNA) 复合。Cas9/tgRNA 复合物与特定靶位点结合而不会触发 DNA 切割。当靶向转录起始位点附近时，这些短的 14-15 nts tgRNA 可有效抑制果蝇体细胞组织中几种靶基因的表达，而不会产生任何可检测到的靶位点突变。 tgRNA 在与 Cas9-VPR 融合蛋白复合时还可以激活靶基因表达或调节增强子活性，并且可以整合到基因驱动中，其中传统 gRNA 维持驱动，而 tgRNA 抑制靶基因表达。
启动子的全基因组核小体分辨率图
摘要 增强子-启动子环路模型长期以来一直主导着基因调控领域，其中增强子通过物理接触激活其靶基因。然而，由于存在替代机制的证据以及缺乏系统验证（主要是由于缺乏合适的实验技术），该模型的普遍性受到了质疑。在本研究中，我们提出了一种新的基于 MNase 的邻近连接方法，称为 MChIP-C，该方法可以在基因组范围内以单核小体分辨率测量蛋白质介导的染色质相互作用。通过应用 MChIP-C 研究 K562 细胞中以 H3K4me3 启动子为中心的相互作用，我们发现与基于限制性内切酶的 C 方法相比，它具有大大提高的分辨率和灵敏度。这使我们能够将 EP300 组蛋白乙酰转移酶和 SWI/SNF 重塑复合物确定为建立和/或维持增强子-启动子相互作用的潜在候选者。最后，利用已发表的 CRISPRi 筛选数据，我们发现大多数经过功能验证的增强子确实与其同源启动子发生物理相互作用，支持增强子-启动子环路模型。
粘液产生，宿主 - 微生物组相互作用，激素敏感性和先天免疫反应在人宫颈芯片中建模
顺式调节元件（CRE）与反式调节剂相互作用以编排基因表达，但是在多基因基因座中如何协调转录调控尚未实验定义。我们试图表征控制相邻共刺激基因CD28，CTLA4和ICO的动态表达的CRE，并编码了T细胞介导的免疫的调节剂。平铺CRISPR干扰（CRISPRI）筛选在常规和调节子集的原代人T细胞中，发现的基因，细胞子集和刺激特异性CRE。与CRISPR敲除筛选和针对转座酶可访问的染色质的测定（ATAC-SEQ）分析确定了在特定的CRISPRI-RESPONSIME元素上影响染色质状态的反式调节剂，以控制共刺激基因表达。然后，我们发现了一个关键的CCCTC结合因子（CTCF）边界，该边界增强了与CTLA4的相互作用，同时还可以防止CD28的混杂激活。通过系统地绘制CRE和相关的反式调节剂直接在原代人T细胞子集中，这项工作克服了长期存在的实验局限性，以解码与免疫稳态至关重要的复杂的多基因基因座中的上下文相关基因调节程序。
基于 CRISPR/dCas9 的系统：植物科学中的机制和应用
摘要：RNA 引导的基因组转录调控工具，即成簇的规律间隔短回文重复序列干扰 (CRISPRi) 和 CRISPR 介导的基因激活 (CRISPRa)，是基因功能研究的强大技术。这两个系统都源自 CRISPR/Cas9 系统，由催化失活的 Cas9 (dCas9)、转录效应物和单个引导 RNA (sgRNA) 组成。这种类型的 dCas9 无法切割 DNA，但保留了其特异性结合 DNA 的能力。dCas9/sgRNA 复合物与靶基因的结合导致转录干扰。CRISPR/dCas9 系统已被探索作为转录调控和基因组成像的工具。尽管 CRISPR/dCas9 系统具有潜在的应用和优势，但它也面临诸多挑战和限制，包括脱靶效应、原间隔区相邻基序 (PAM) 序列要求、高效的递送方法以及 CRISPR/dCas9 干扰作物在多个国家被标记为转基因生物。本综述重点介绍了 CRISPR/dCas9 技术的进展及其在作物改良中的应用和潜在挑战。
SWISS：利用 Cas9 切口酶和工程 CRISPR RNA 支架在植物中进行多重正交基因组编辑
背景 单核苷酸替换、基因表达改变或有害基因的去除是植物许多重要农学性状的分子基础[1]。堆叠性状或改变调控途径的几个关键因素将极大地促进作物育种[1]。CRISPR-Cas 系统的多样性和简单性提供了强大的分子工具箱[2-10]。已采用多种策略在细菌、酵母和哺乳动物细胞中实现多重应用[11-16]。正交基因组操作最常用的多重策略包括几个正交 CRISPR 系统形成多功能 CRISPR 系统，例如使用 SpCas9 变体作为腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和 SaCas9 作为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的双功能方法[17]，或使用 LbCpf1 变体作为 CRISPRa、SpCas9 变体作为 CRISPRi 和 SaCas9 变体作为删除的三功能方法[15]。然而，这些策略需要同时递送多个 Cas 蛋白，并且每个 Cas 蛋白都需要自己的 PAM 识别 [ 15 , 17 ]。另一方面，各种 RNA 适体被整合到 CRISPR RNA 支架中，这些适体
使用高通量测量值在各种情况下开发紧凑的转录效应子
转录效应子是已知激活或抑制基因表达的蛋白质结构域。但是，缺乏对哪种效应域调节转录的系统性理解。在这里，我们开发了DCAS9介导的高通量募集（HT-RECRUIT），这是一种合并的筛选方法，用于量化内源性靶基因的效应子功能和测试效应子功能，用于包含各种环境的5,092个库中的库。我们还使用较大的文库瓷砖调节剂和转录因子来绘制从未注释的蛋白质区域绘制的效应子的上下文依赖性。我们发现许多效应子取决于目标和DBD上下文，例如可以充当激活因子或阻遏物的HLH域。为了实现有效的扰动，我们选择了包括ZNF705 KRAB在内的上下文固定域，从而改善了CRISPRI工具以使启动子和增强子保持沉默。我们通过结合NCOA3，FOXO3和ZnF473结构域来设计一种称为NFZ的紧凑型人类激活剂，该结构域可以通过更好的病毒递送和对嵌合抗原受体T细胞的诱导控制有效的CRISPRA。
Adam Yaari
MTAP基因的纯合缺失是癌症中最常见的遗传改变之一，影响了所有人类癌症的10-15％。开发了包括TNG908和TNG462在内的临床MTA合并PRMT5抑制剂，以利用PRMT5抑制和MTAP缺失之间充分表征的合成致死相互作用。的确，第一个披露的MTA合作性PRMT5抑制剂的临床数据证明了TNG908在MTAP删除的肿瘤中有选择性地抑制PRMT5的能力，同时在患者中保留邻近的正常，MTAP-Profofoffic-Profofoffic-MTAP-Profofoffoffient。为了进一步探索MTA骨骼删除细胞中MTA合件性PRMT5抑制剂的作用机理，我们采用了多个基于CRISPR的编辑平台（CRISPRN，CRISPRI和CRISPRA）来进行无偏MTA合件性PRMT5抑制剂锚固筛网，并在In In In In In Intro和Vivo中进行。代表多种组织学的癌症模型揭示了潜在的PRMT5抑制剂敏化和耐药途径，这些途径还包括特定于MTA合并抑制剂的机制。Specifically, the results of these screens identify 1) the effect of MTA/SAM metabolism on MTA-cooperative PRMT5 inhibitors, and 2) identification of potential sub-stratification strategies for patients with MTAP-deleted cancer, and 3) the activity of PRMT5 in anti-apoptotic pathways and synergy between PRMT5 and BCLxL inhibition.
目标活动预测可以改进 CRISPR-...
利用 Cas9 的催化失活突变体（称为 dCas9）阻断细菌基因表达的能力正迅速成为一种标准方法，用于探测基因功能、进行高通量筛选和设计细胞以达到预期目的。然而，我们仍然缺乏对决定 dCas9 靶向活性的设计规则的良好理解。利用高通量筛选数据，我们建立了一个模型，根据靶序列预测 dCas9 阻断 RNA 聚合酶的能力，并在独立生成的数据集上验证其性能。我们进一步为大肠杆菌 MG1655 EcoWG1 设计了一个新型的全基因组向导 RNA 文库，使用我们的模型选择具有高活性的向导，同时避免可能有毒或具有脱靶效应的向导。在富集培养基中生长期间使用 EcoWG1 库进行的筛选比之前发布的筛选有所改进，表明仅使用少量精心设计的指南即可获得非常好的性能。能够设计有效的小型库将有助于使 CRISPRi 筛选更容易执行且更具成本效益。我们的模型和材料可通过 crispr.pasteur.fr 和 Addgene 向社区提供。
目标活动预测可以改进 CRISPR–...
利用 Cas9 的催化失活突变体（称为 dCas9）阻断细菌基因表达的能力正迅速成为一种标准方法，用于探测基因功能、进行高通量筛选和设计细胞以达到预期目的。然而，我们仍然缺乏对决定 dCas9 靶向活性的设计规则的良好理解。利用高通量筛选数据，我们建立了一个模型，根据靶序列预测 dCas9 阻断 RNA 聚合酶的能力，并在独立生成的数据集上验证其性能。我们进一步为大肠杆菌 MG1655 EcoWG1 设计了一个新型的全基因组向导 RNA 文库，使用我们的模型选择具有高活性的向导，同时避免可能有毒或具有脱靶效应的向导。在富集培养基中生长期间使用 EcoWG1 库进行的筛选比之前发布的筛选有所改进，表明仅使用少量精心设计的指南即可获得非常好的性能。能够设计有效的小型库将有助于使 CRISPRi 筛选更容易执行且更具成本效益。我们的模型和材料可通过 crispr.pasteur.fr 和 Addgene 向社区提供。
lig1失活选择性地抑制BRCA1突变细胞在体外和体内的生长
我们在11个BRCA1/2野生型和2个BRCA1突变癌细胞系中进行了CRISPR筛选，以识别与BRCA1突变合成致死的靶标。除了USP1，PARP1和POLQ外，我们还将DNA连接酶基因lig1确定为新的靶标，当被击倒后，会选择性地杀死BRCA1突变细胞。对乳腺癌和卵巢癌细胞系中Achilles数据库中BRCA突变的内部分析进一步验证了BRCA1突变细胞在LIG1上的超依赖性。使用CRISPRN，CRISPRI和RNAI对LIG1的单基因扰动证实了LIG1在BRCA1突变细胞系中失活的致命作用，但不能BRCA1/2野生型细胞系。可以通过与外源性野生型LIG1 cDNA相辅相成，证明遗传工具的目标性质可以挽救这种生存能力。使用可降解的DNA连接酶I融合蛋白，我们证明了DNA连接酶I蛋白水平与BRCA1突变细胞中的生存能力之间存在很强的相关性。酶上无活性的DNA连接酶I突变蛋白（LIG1 K568A）无法营救由内源性LIG1耗竭引起的生存力的损失，从而从小分子抑制剂的角度来支持该靶标的易生化性。使用BRCA1突变体MDA-MB-436衍生的肿瘤在体内复制这些数据，其中肿瘤生长在LIG1丢失后抑制了> 80％。