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双向表观遗传编辑揭示基因调控的层次结构
CRISPR 扰动是研究基因组功能效应的宝贵工具。然而，现有方法在研究非编码元件和遗传相互作用方面的效用有限。在这里，我们开发了一个双向表观遗传编辑系统 (CRISPRai)，其中正交激活 (CRISPRa) 和抑制 (CRISPRi) 扰动同时应用于同一细胞的多个基因座。我们开发了双 gRNA 捕获单细胞 Perturb-seq 来研究两种造血谱系转录因子 SPI1 和 GATA1 之间已建立的相互作用，并发现了共同调节基因的新型上下文特定调控模式。将 CRISPRai 扩展到非编码元件，我们解决了多个增强子如何相互作用以调节 T 细胞中共同靶基因白细胞介素-2 的表达。我们发现增强子功能主要是附加的并能够对基因表达进行微调，但在基因表达控制强度方面，增强子之间存在明显的层次结构。启动子在控制基因表达方面比大多数增强子占主导地位；然而，一小部分增强子表现出强大的功能效应或守门人功能，尽管启动子被激活，但仍可以关闭基因。将这些功能数据与组蛋白 ChIP-seq 和 TF 基序富集相结合，表明存在多种增强子介导的基因调控模式。我们的方法 CRISPRai 用于双向表观遗传编辑，提供了一种识别新遗传相互作用的方法，这些相互作用在没有双向扰动的情况下进行研究时可能会被忽视，并且可以应用于基因和非编码元件。
用于超高动态范围基因扰动的化学诱导 CRISPR/Cas9 电路
CRISPR/Cas9 技术为疾病建模和了解基因与表型之间的联系提供了独特的能力。在培养细胞中，化学介导的 Cas9 活性控制可以限制脱靶效应，并实现对必需基因的机制研究。然而，广泛使用的 Tet-On 系统通常显示“泄漏”的 Cas9 表达，导致意外编辑，以及诱导时活性较弱。泄漏在 Cas9 核酸酶活性的背景下可能是一个明显的问题，这可能导致 DNA 损伤的累积和靶细胞基因组的降解。为了克服这些缺陷，我们建立了转基因平台，以最大限度地减少 Cas9 在关闭状态下的功能，同时最大限度地提高和不损害开启状态下的基因编辑效率。通过结合条件性不稳定和 Cas9 抑制，我们开发了一种一体化（一个或多个向导 RNA 和 Cas9）超紧密、Tet 诱导系统，在各种细胞系和靶标中具有出色的动态范围（开启状态与关闭状态）。作为 Tet 介导诱导的替代方案，我们创建了一个 branaplam 调节的剪接开关模块，用于低基线和强大的 Cas9 活性控制。最后，对于需要避免 DNA 损伤的情况，我们构建了一个双重控制、Tet 诱导的 CRISPRi 模块，用于紧密和有效的转录沉默。这套升级的诱导型 CRISPR 系统可广泛应用于多种细胞类型和实验条件。
基因组编辑旨在提高营养利用效率和营养胁迫适应性
近年来，RNA 引导的基因组编辑 (CRISPR-Cas9 技术) 的发展彻底改变了植物基因组编辑。在营养缺乏条件下，不同的转录因子和调控基因网络共同作用以维持营养稳态。提高氮 (N)、磷 (P) 和钾 (K) 的利用效率对于确保可持续产量、提高质量和抗逆性至关重要。本综述概述了适合基因组编辑的潜在目标，以了解和提高营养利用 (NtUE) 效率和营养胁迫耐受性。还描述了使用关键负调节剂和正调节剂的不同基因组编辑策略。营养信号的负调节剂是基因组编辑的潜在目标，可在资源匮乏的条件下改善营养吸收和应激信号。通过 CRISPR/dead (d) Cas9 (dCas9) 胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑和主要编辑进行的启动子工程是产生精确变化的成功策略。 CRISPR/dCas9 系统还具有利用转录激活因子/抑制因子以有针对性的方式过度表达目标基因的额外优势。CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 是 CRISPR 的变体，其中实现了 dCas9 依赖的转录激活或干扰。dCas9-SunTag 系统可用于设计植物中的靶向基因激活和 DNA 甲基化。通过 CRISPR-Cas 技术开发营养利用效率高的植物将加快作物营养胁迫耐受性遗传改良的速度，并提高农业的可持续性。
可诱导的 CRISPR 表观基因组系统模拟可卡因诱导的 Nab2 和 Egr3 双向调控
物质使用障碍是一种慢性疾病，也是世界各地导致残疾的主要原因。NAc 是介导奖励行为的主要大脑中枢。研究表明，接触可卡因与 NAc 中等棘神经元亚型 (MSN)、多巴胺受体 1 和 2 富集的 D1-MSN 和 D2-MSN 的分子和功能失衡有关。我们之前报道过，反复接触可卡因会在 NAc D1-MSN 中诱导转录因子早期生长反应 3 (Egr3) mRNA，而在 D2-MSN 中降低该mRNA。在这里，我们报告了在雄性小鼠中反复接触可卡因会诱导 Egr3 辅阻遏物 NGFI-A 结合蛋白 2 (Nab2) 的 MSN 亚型特异性双向表达的发现。使用 CRISPR 激活和干扰 (CRISPRa 和 CRISPRi) 工具结合 Nab2 或 Egr3 靶向的 sgRNA，我们模拟了 Neuro2a 细胞中的这些双向变化。此外，我们研究了雄性小鼠反复接触可卡因后 NAc 中组蛋白赖氨酸脱甲基酶 Kdm1a 、 Kdm6a 和 Kdm5c 的 D1-MSN 和 D2-MSN 特异性表达变化。由于 Kdm1a 在 D1-MSN 和 D2-MSN 中表现出双向表达模式，就像 Egr3 一样，我们开发了一种光诱导的 Opto-CRISPR-KDM1a 系统。我们能够下调 Neuro2A 细胞中的 Egr3 和 Nab2 转录本，并引起与我们在小鼠反复接触可卡因模型的 D1-MSN 和 D2-MSN 中观察到的类似的双向表达变化。相反，我们的 Opto-CRISPR-p300 激活系统诱导了 Egr3 和 Nab2 转录本并引起相反的双向转录调控。我们的研究揭示了可卡因作用中特定 NAc MSN 中 Nab2 和 Egr3 的表达模式，并使用 CRISPR 工具进一步模拟这些表达模式。
应用基于 CRISPR/Cas 的基因编辑技术培育更优良的香蕉
香蕉（Musa spp.），包括芭蕉，是亚热带和热带地区 140 多个国家种植的主要粮食和经济作物之一，全球年产量约为 1.53 亿吨，养活了约 4 亿人。尽管香蕉种植广泛且适应多种环境，但其生产面临着农业景观中经常共存的病原体和害虫的重大挑战。基于 CRISPR/Cas 的基因编辑的最新进展提供了变革性解决方案，可提高香蕉的恢复力和生产力。肯尼亚国际热带农业研究所的研究人员已成功利用基因编辑赋予香蕉对香蕉枯萎病 (BXW) 等疾病的抗性，方法是针对易感基因，并通过破坏病毒序列来抵抗香蕉条纹病毒 (BSV)。其他突破包括开发半矮化植物和增加 β-胡萝卜素含量。此外，经菲律宾监管部门批准，已开发出不易褐变的香蕉以减少食物浪费。香蕉基因编辑的未来前景一片光明，基于 CRISPR 的基因激活 (CRISPRa) 和抑制 (CRISPRi) 技术有望提高抗病性。Cas-CLOVER 系统为 CRISPR/Cas9 提供了一种精确的替代方法，证明了成功生成了基因编辑的香蕉突变体。精准遗传学与传统育种的结合，以及采用无转基因编辑策略，将是充分发挥基因编辑香蕉潜力的关键。作物基因编辑的未来前景令人振奋，可以生产出在不同的农业生态区茁壮成长、营养价值极高的香蕉，最终使农民和消费者受益。本文强调了 CRISPR/Cas 技术在提高香蕉的抗逆性、产量和营养品质方面的关键作用，对全球粮食安全具有重要意义。
实现多千碱基长距离传输的方法和技术......
1 CRISP-HR Therapeutics，加利福尼亚州圣卡洛斯 94070 摘要 CRISPR 支持的细胞和基因疗法有可能彻底改变遗传医学领域。然而，由于当前工具和技术的局限性，绝大多数罕见病仍然无法治愈。到目前为止，大多数矫正治疗方法仅限于逐个突变的方法，其中 HDR 或较新的技术（如碱基编辑或主要编辑）一次重写小片段 DNA（~1-100 bp）。虽然这些方法很强大，但短编辑窗口（相对于人类基因的大小）在经济和/或技术上与大多数罕见疾病突变谱不兼容。在这里，我们首次证明 CRISPR/Cas9 可用于通过我们称为“长距离重写”的无选择过程同时“重写”人类基因组的 7kb+ 部分。长距离重写方法与多种核酸酶、细胞类型和基因组位点兼容，并且可以与基于双链断裂 (DSB) 和非 DSB 的方法一起使用。简介 CRISPR 和相关技术已被证明在从基础研发到工业以及最近的治疗应用的各个领域都非常有用。CRISPR/Cas9 系统最基本的用途是针对基因组中的特定 DNA 片段并创建小的插入或删除 (INDEL) 来破坏各种遗传元素（蛋白质编码序列、启动子/增强子、剪接位点等）。1–4 虽然这是一种强大的技术，但由于“破坏”基因可产生治疗益处的疾病非常有限，因此该方法在治疗应用方面受到限制。此外，人们越来越担心通过有害的双链断裂 (DSB) 介导的编辑产生的不良局部和全局副作用。5,6 因此，人们一直在努力开发工具和技术，以实现更可编程和更复杂的编辑，同时减少不良副作用。这些努力促成了各种具有扩展功能的 Cas9 融合蛋白的开发，例如 Base 和 Prime 编辑器 7,8 、CRISPRa 和 CRISPRi 9,10 、旨在操纵内源性修复途径选择的 Cas 蛋白工程 11-13 ，以及无数其他功能 14 。这些努力使得我们能够选择性地替换特定碱基、将任何碱基交换为另一个碱基、在不进行基因组修饰的情况下调节基因表达，以及操纵
用于异源基因组编辑和转录调制
摘要1类I型CRISPR-CAS系统代表了本质上最丰富，最多样化的CRISPR系统。然而，它们在通用基因组编辑中的应用受到了在异源宿主中引入特定类别的多组分效应子进行功能的困难。在这里，我们建立了一个可转让的级联系统，该系统可以通过共轭在臭名昭著的顽固性和多样化的铜绿假单胞菌基因组中稳定的整合和表达。在不同的遗传背景下，转移的级联反应显示出比CAS9系统更高的DNA干扰活性和更高的编辑能力，包括以效率和简单性去除大型（21-kb）集成盒。在基因型中启用了一个高级λred-i-f系统，具有较差的同源重组能力，缺乏序列信息的临床分离株以及含有抗Crispr元素ACR的细胞。最后，通过同时引入级联反应和微型千里阵列，以单步中表达所需的crrna，开发了一个“多合一” I- F级别介导的CRISPRI平台，用于转录调制。这项研究提供了一个框架，用于扩展多种I型级联反应，用于广泛，异源基因组编辑和在非模型病原体分离株中的编辑技术的建立。引言定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CAS）构成原核生物中的适应性免疫系统，该系统通过RNA引导的核酸破坏来抵御异物元素（1,2）。基因组编辑和治疗应用已集中在2类CRISPR-CAS系统上，因为它们对单个多功能效应子（例如Cas9和cas12a）对DNA干扰（3,4）。但是，2类系统仅代表了在原核生物中自然编码的CRISPR-CAS系统的〜10％（5）。他们在编辑细菌基因组中的应用经常受到较差的转化，细胞毒性和对物种特异性优化的优化的要求，对大型CAS9/CAS9/CAS12A蛋白的异源表达（6-8）。与真核生物中工具的快速上升和扩展相反，到目前为止，基于CAS9/CAS12A的基因组编辑仅在几种模型细菌菌株中才能成功建立。缺乏一种基于CRISPR的主要编辑策略，很容易适用于各种细菌物种。非常明显，将近50％的细菌和90％的古细菌基因组编码本地CRISPR-CAS系统和90％的自然存在的CRISPR-CAS系统属于1类系统，这些系统属于1级系统，这些系统通过称为级联的多组分效应物复合物（CRISPR-PR-PR-PRAPER-COMPAIDE COMPLECT）（CRISPR-PRAPER-SAPERAPIDECTER complace for Attiviral Sevipers of Viviral Defersication）（9,10）（9,10）。尽管这些效应子的复杂性在某种程度上阻碍了它们在真核生物中的广泛应用，但它们的流行率和多样性，尤其是1类I型系统，占所有CRISPR-CAS系统的50％，占具有七个子类型的所有CRISPR-CAS系统（即i-a至i-f plus i-u）为细菌和古细菌中基于内源性CRISPR-CAS基于内源性CRISPR-CAS的遗传开发开辟了新的途径（11）。该方法通过简单地输送一个经常在单个质粒中组装的编程的微型CRISPR阵列和所需的维修供体来运行，并将其用于原核生物细胞，从而以简单性和效率实现基因组编辑。采用该策略，编辑了几种遗传性顽固生物，例如工业细菌梭状芽胞杆菌casteurianum atcc6013（I型I-B）（12）（12），抗多药耐药性pseudomonas aeruginosa aeruginosa Genotype pa154197（I型I-f）（I型I-F）（13）和
RAMÓN Y CAJAL 奖学金——2023 年申请征集......
主题领域：生物科学和生物技术 姓名：SANTOS MORENO, JAVIER 参考号：RYC2023-043017-I 电子邮箱：santosmoreno.j@gmail.com 职称：合成生物学家，研究基因回路对细胞行为的编程 履历：我拥有生物技术硕士学位（萨拉曼卡大学）和临床分析实验室硕士学位（庞培法布拉大学）。我在不到 3 年的时间里（2016 年，26 岁）在巴黎（索邦大学巴黎城分校）获得博士学位，研究蛋白质分泌。我研究了细菌（K. oxytoca）II 型分泌系统 (T2SS) 的分子机制，为此我描述了新的蛋白质相互作用并产生了重要的结果，这使我提出了一种新的 T2SS 分泌模型。在瑞士洛桑做博士后期间，我将研究重点从研究现有生物系统转向构建新系统。在研究大肠杆菌的过程中，我率先使用 CRISPRi 构建了一些最重要的合成电路（包括图案化电路、振荡器或双稳态开关），并将这些电路用于不同的应用，包括进化研究、人类病原体（S. penuemoniae）感染研究或细菌细胞生理学的重新编程。我目前在巴塞罗那进行研究，最初以玛丽居里研究员的身份进行，现在以胡安德拉谢尔瓦研究员的身份进行，旨在设计人类皮肤微生物组用于诊断和治疗目的。我成功地将最丰富的皮肤细菌（痤疮梭菌）变成了一种可常规转化的生物体，我为这种细菌开发了第一个分子工具箱（包括启动子、报告基因、转录因子、CRISPR 工具等），并且我构建了一种痤疮梭菌菌株，该菌株在人类皮肤细胞培养物中产生并分泌具有 ROS 清除活性的分子，这在治疗炎症性皮肤病方面具有巨大潜力。2023 年 9 月，我获得了 230 万欧元的 ERC 启动基金。我未来的研究将专注于活细胞中的编程时间。目前，我们对细胞随时间变化进行编程的能力仍然非常有限。我们依靠精确定时的人工干预或控制重复过程的分子振荡器，但我们仍然无法对细胞进行编程以在所需的时间自主执行自定义操作。我现在打算通过在 E. coli 中生成分子计时器来计算时间并在指定时间执行所需的操作，从而朝着这个目标迈出一大步。计时器将具有高度可编程性、可重复使用性和可扩展性，我将使用一种简单而有效的方法将时间可编程性扩展到其他生物体（包括酵母和哺乳动物细胞）。最后，我将利用生物计时器的潜力，将其用于不同的应用，包括：在生物控制中，在期望的时间后进行细胞程序性死亡；精确控制任务执行顺序和时间，用于生物生产；以及在期望的时间窗口内记录（外）细胞事件的“哨兵”细胞，用于生物传感。我的研究结果将释放出无数新的可能性，包括基础的和应用的。例如，在开放或难以接近的环境中（例如农田或受污染的湖泊）部署工程细胞最终可能成为现实，因为任务执行和自我毁灭将被遗传编码为在预定的时间发生。此外，编程的时间指令可以避免在大型生物反应器中对昂贵的诱导信号的需求，或者使研究发育过程时受到的外部干扰最小。总之，我的团队将开发出非常需要的、突破性的测量和编程细胞时间的能力。