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“ CRISPR-CAS3，下一代基因组编辑技术：机制和应用”
副教授Yoshimi hitoshi] 基因组编辑技术实际上重写了基因组信息，在过去的十年中已经迅速发展，并且可以自由修改各种生物的遗传信息。这项技术已用于许多工业领域，包括医疗，育种和生物生产。通过开发了许多用于基因组编辑的工具，我们已经表明，在高等生物中，E. coli-dyper的I-E CRISPR-CAS3的应用可以用作基因组编辑技术。该网络研讨会介绍了国内基因组编辑技术的最前沿，其中包括CRISPR-CAS3如何使用基因组编辑，可以使用哪些生物以及如何在社会中实施的特定示例。
国产基因组编辑技术——CRISPR-Cas3
该服务涉及用于 CRISPR-Cas3 基因组编辑的 crRNA 的设计以及 crRNA 与 Cas 蛋白复合物的创建（用于抗病毒防御的 Cas 复合物、Cascade-crRNA 复合物）。我们共同表达组成Cascade的五种蛋白质和一种crRNA，并传递纯化的Cascade-crRNA复合物。 此外，组成 Cascade（Cas11、Cas7 和 Cas6）的蛋白质含有核定位信号 (NLS)。 该服务制备的Cascade-crRNA复合物可与Cas3蛋白NLS（编号311-09441）的切割活性结合用于CRISPR-Cas3体系。
遗传学 利用 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在哺乳动物细胞和小鼠中产生精确的大片段缺失
目前，Cas9 和 Cas12a 系统被广泛用于基因组编辑，但它们精确产生大片段染色体缺失的能力有限。I-E 型 CRISPR 介导广泛和单向的 DNA 降解，但迄今为止，控制 Cas3 介导的 DNA 缺失的大小已被证明是难以捉摸的。在这里，我们证明了 Cas9 的内切酶失活 (dCas9) 可以精确控制哺乳动物细胞中 Cas3 介导的大片段缺失。此外，我们分别报告了使用 CRISPR/Cas3 和 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在小鼠中消除 Y 染色体和精确保留 Sry 基因。总之，dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 介导的精确大片段缺失为通过染色体消除建立动物模型提供了一种方法。该方法也有望成为治疗涉及额外染色体的片段突变或人类非整倍体疾病的潜在治疗策略。
Exait：可解释的个性化学习的可解释的人工智能工具
为了恢复Duchenne肌肉营养不良（DMD）的各种突变模式中的肌营养不良蛋白，已经研究了多外观跳过（MES）方法。但是，只有有限的技术可以诱导大量缺失，以覆盖几百千倍酶的目标外显子。在这里，我们利用CRISPR-CAS3系统进行了MES诱导，并表明双重CRRNA可以在肌营养不良蛋白外显子45-55个区域（340 KB）诱导大量缺失，可以应用于各种类型的DMD患者。我们开发了一种基于SSA的两种基于SSA的记者系统，用于富含基因组编辑的细胞群，并证明MES诱导恢复了具有三个不同突变的DMD-IPSC中的肌营养不良蛋白蛋白。全基因组测序和距离分析在推定的CRRNA结合位点附近未检测到未明显的脱靶删除。总的来说，双CRISPR-CAS3是通过MES诱导诱导巨大基因组缺失并恢复肌营养不良蛋白蛋白的有前途的工具。
一种基于 SEVA、CRISPR-Cas3 辅助的假单胞菌基因组工程方法，可实现载体高效消除
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2023 年 6 月 29 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.06.29.547033 doi：bioRxiv 预印本
结肠癌生物标志物：对个性化的影响...开发了链霉菌的CRISPR-CAS3基因组编辑系统
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“利用 CRISPR-Cas3 在人类多能干细胞中引入大量基因组缺失”。引自：当前协议
CRISPR-Cas 系统为研究人员提供了真核基因组编辑工具和治疗平台，可以靶向体细胞器官中的疾病突变。大多数此类工具采用 II 型（例如 Cas9）或 V 型（例如 Cas12a）CRISPR 酶在基因组中造成 RNA 引导的精确双链断裂。然而，此类技术在进行有针对性的大片段缺失方面能力有限。最近，在微生物中普遍存在并表现出独特酶特征的 I 型 CRISPR 系统已被用于有效地在人类细胞中造成大片段染色体缺失。I 型 CRISPR 首先使用一种称为 Cascade 的多亚基核糖核蛋白 (RNP) 复合物来找到其引导互补的靶位，然后招募解旋酶核酸酶 Cas3 沿着目标 DNA 行进并以高持续性进行长距离撕裂。当以纯化的 RNP 形式引入人体细胞时，CRISPR-Cas3 复合物可有效诱导 CRISPR 靶位点上不同长度（1-100 kb）的大型基因组缺失。由于这种独特的编辑结果，CRISPR-Cas3 在诸如去除整合的病毒基因组和研究影响基因功能和人类疾病的结构变异等任务中具有巨大前景。在这里，我们提供了使用 CRISPR-Cas3 引入大型缺失的详细方案。我们描述了从 Thermobifida fusca 中纯化 IE 型 CRISPR 蛋白 Cascade 和 Cas3、将 RNP 电穿孔到人体细胞中以及使用 PCR 和测序表征 DNA 缺失的分步程序。我们在此重点关注人类多能干细胞，因为它们具有临床潜力，但这些方案将广泛应用于其他细胞系和模型生物，包括大型基因组缺失、全基因或染色体去除、以及非编码元素的 CRISPR 筛选等。© 2022 Wiley Periodicals LLC。