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crispr/cas9
图片：https：//www.emmanuelle-charpentier-lab.org/research/on-crispr-cas-9/ http://sitn.hms.harvard.edu/flash/flash/2014/2014/crispr-a-a-game-a-game-game-game-game-game-changing-genet-genect-game-genet-genet-genet-genet-genet-genet-genet-genecine-tech-technique/
在人类疾病疗法中使用CRISPR/CAS9方法
封面图片来源：https：//www.drugtargetreview.com/news/74139/nobel- priper--in-hamistry-award-to-scientists-scientists-iho-iho-difcovered-rispr-cas9/
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CRISPR相关蛋白9（CAS9）是RNA引导的DNA核酸酶，是Pyogenes链球菌CRIS-CRISPR-antivirAniviral免疫系统的组成部分，可提供针对外肌小体遗传材料的适应性免疫。CRISPR抗病毒作用的机制涉及三个步骤：（i）宿主细菌获取外国DNA； （ii）CRISPR RNA（CRRNA）的合成和成熟，然后形成RNA-CAS核酸酶 - 蛋白质复合物； （iii）通过宿主细菌获取外源DNA；该络合物识别出外源DNA，并通过CAS核酸酶活性通过裂解而定向干扰。II型CRISPR/CAS抗病毒免疫系统为精确的基因组编辑提供了强大的工具，并具有特定调节基因和治疗应用的潜力。必须在细胞中引入或表达CAS9蛋白和引导RNA（包括CRRNA和反式激活CRRNA（tracroRNA）之间的融合）。导向RNA的5'末端的20个核苷酸序列将Cas9引导到特定的DNA靶位点。因此，可以“编程” Cas9以在体外以及细胞和生物中切割各种DNA位点。CRISPR/CAS9基因组编辑工具已用于包括小鼠和人类细胞在内的许多生物中。研究表明，CRISPR可用于在啮齿动物和灵长类动物胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因。
什么是 CRISPR/Cas9？
另一种研究 CRISPR/Cas9 的疾病是杜氏肌营养不良症 (DMD)。Tabebordbar 等人最近使用腺相关病毒 (AAV) 传递 CRISPR/Cas9 内切酶，通过删除含有原始突变的外显子，恢复杜氏肌营养不良症小鼠模型中的肌营养不良蛋白表达。这会产生截短但仍有功能的蛋白质。经治疗的小鼠显示肌肉功能缺陷部分恢复。5 值得注意的是，研究表明肌营养不良蛋白基因是在补充成熟肌肉组织的肌肉干细胞中编辑的。这对于确保 CRISPR/Cas9 的任何治疗效果不会随着时间的推移而消失非常重要。两项类似的研究描述了在体内使用 CRISPR/Cas9 系统来增加杜氏肌营养不良症小鼠模型中的肌营养不良蛋白基因表达并改善肌肉功能。 6 7 其他研究已使用 CRISPR/Cas9 在体外靶向复制人类肌营养不良蛋白基因的外显子，并表明这种方法可导致 DMD 患者的肌小管中产生全长肌营养不良蛋白。 8
crispr/cas9系统∗
经常说，世界上最伟大的战斗是微生物之一。的确，如果我们考虑微生物采用的攻击者使用的策略，这并不夸张。这样的战争是噬菌体（病毒）对细菌的攻击。细菌针对入侵病毒采用的一种重要策略是利用群集的定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）和CRISPR相关的核酸酶（CAS），通常称为CRISPR-CAS系统。crispr可在50％的现代细菌和90％的古细菌基因组中发现[1]。Charpentier的尖端研究工作，他曾在维也纳大学工作，后来在瑞典进行微生物研究的Umeå研究，导致发现了CRISPR系统中必不可少的组成部分，RNA分子是一种必不可少的组成部分，这是一种
TRUECUT™CAS9蛋白
Invitrogen™TRUECUT™Cas9蛋白用于使用CRISPR技术的基因组编辑应用。cas9蛋白与CRISPR-CAS9系统的引导RNA（GRNA）成分形成非常稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物。纳入核定位信号（NLS）的掺入有助于其向细胞核的传递，从而增加了基因组DNA裂解的速率。与质粒系统相比，它可以迅速清除，从而最大程度地减少了脱靶裂解的机会（Liang等，2015）。与基于质粒的CRISPR系统相比，CAS9核酸酶已在多种悬浮液和粘附细胞系中进行了测试，并且显示出优异的基因组裂解效率和细胞的生存能力。
CRISPR/Cas9 gRNA 载体
• 并行使用至少两个独立的 gRNA 序列来获得不同的克隆。通过基因组编辑创建的模型使用不同的 gRNA，这些 gRNA 共享靶位点，但不共享脱靶位点，是创建独立重复的绝佳方法。 • 为每个使用的 gRNA 分离多个独立的克隆细胞群。在独立克隆中，脱靶 DSB 发生在相同位点的可能性非常低。 • 虽然很少有实验室有资源进行统计上强大的全基因组测序验证协议（例如 gUIDEseq），但相对容易地为每个您使用的 gRNA 选择几个预测的脱靶序列，然后围绕这些位点进行测序，以确保没有引入脱靶插入/缺失。
CRISPR/CAS9基因编辑
基因治疗的最新进展已在多种疾病的实验研究中显示出巨大潜力，包括糖尿病 (DM)。成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 及其 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 已实现位点特异性基因编辑，Cas9 是一种导致双链 DNA 断裂的第三代核酸酶。此过程允许插入、删除或沉默任何所需基因。小鼠研究表明，糖尿病状态可以通过特定的基因靶向来逆转。其他研究已针对肥胖和肥胖相关基因作为改善胰岛素抵抗和提供更好的代谢稳态的替代方案。目前正在进行研究以确定使用 CRISPR 系统治疗糖尿病的最佳策略。本综述旨在分析由 CRISPR-Cas9 介导的不同实验基因治疗研究，以确定其作为未来可能的糖尿病治疗方法的有效性、安全性和可靠性。同样，将回顾有关 CRISPR/cas9 的基本概念。