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哺乳动物基因组调节和编辑的工程小型CRISPR-CAS系统
紧凑型和多功能的CRISPR-CAS系统将在各种环境中通过高功能交付来实现基因组工程应用。在这里，我们创建了一种通过引导RNA和蛋白质工程设计从V型Cas12f（Cas14）系统设计的有效的微型CAS系统（Casmini），该系统的大小不到当前使用的CRISPR系统（CAS9或CAS12A）的一半。我们证明，Casmini可以驱动高水平的基因激活（最大增加），而天然CAS12F系统无法在哺乳动物细胞中起作用。我们表明，Casmini系统具有与CAS12A相当的基因激活活动，具有高度特定的，并且允许稳健的基础编辑和基因编辑。我们期望Casmini对细胞工程和基因治疗应用具有广泛的用处，并在体内和体内有用。
一种用于体内基因组编辑的新型紧凑型 Cas12a 变体
为了使通过腺相关病毒 (AAV) 载体进行的基因治疗取得成功，载体基因组大小是一个主要制约因素，因为它会阻止将较大的转基因包装到二十面体病毒衣壳中。在基于 CRISPR 的基因组编辑背景下，已经描述了多种紧凑型 Cas 变体，例如 Cas12j (CasPhi) 或 Cas12f (CasMINI) [ 1 , 2 ]，它们可用于通过 AAV 递送进行体内基因组编辑。在 Wang 等人的研究中 [ 3 ]，一种来自丹毒菌 (EbCas12a) 的新型紧凑型 Cas12a 变体被表征为当通过点突变 (enEbCas12a) 改进时，显示出与其他 Cas12a 变体相似的编辑效率 [ 3 ]。值得注意的是，EbCas12a 的编码序列比下一个更大的已表征 Cas12a 变体小约 150 bp（图 1），有利于将其容纳在“一体化” AAV 载体中，该载体在单个 AAV 模板上提供 Cas12a 和 crRNA。通过使用单一载体给药，作者证明了新型 AAV-enEbCas12a 载体介导体内基因组编辑的能力，从而为不断扩展的 CRISPR 工具箱增加了一个新条目。首先，作者通过体外切割试验表征了 EbCas12a，并确定 TTTV（V = G、C 或 A）为 PAM 序列，这与其他已报道的 Cas12a 系统类似。接下来，EbCas12 被证明在培养的哺乳动物细胞中具有功能性，这通过两个报告基因和各种基因组位点的切割得到证实。然而，与其他 Cas12a 变体（例如常用的 AsCas12a 和 LbCas12a）相比，EbCas12a 效率较低。因此，为了放宽 PAM 序列限制并提高 AsCas12a 的编辑效率，作者们在 EbCas12a 中替换了一个氨基酸，以建立 PAM 近端 DNA 接触，从而产生了变体 enEbCas12a。事实上，这种单点突变将基因组位点的编辑效率提高了约 2 倍。然而，与此同时，放宽 PAM 序列限制可能会增加 enEbCas12a 脱靶编辑的风险。为了通过实验检验这一担忧，对脱靶编辑事件进行了全基因组分析。值得注意的是，检测到的脱靶位点数量为