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使用 Covaris® 进行自动化 NGS 文库制备
为了证明此工作流程的效率和多功能性，使用 Covaris® LE220-plus 聚焦超声波发生器在 96 microTUBE™ AFA™ 纤维板中剪切 DNA 样本。然后从仪器中取出板并放置在 Sciclone G3 NGSx 工作站上可手动安装的板适配器下，如图 4 所示。使用 Revvity LabChip® GX Touch™ 核酸分析仪分析分子量
桑格生命之树HMW DNA碎片：Covaris g- ...
本协议描述了通过生命HMW DNA提取方案制备的样品中的HMW DNA的离心介导的HMW DNA片段化。该协议使用Covaris g-tube产生8–10 kb尺寸范围的片段。剪切的DNA适用于下游长读取测序，包括超低输入（ULI）库制备后的PACBIO测序。这个过程对于生命树计划中所有分类学组的DNA提取物非常有效。该协议的输出是剪切的DNA，可以使用手动或自动SPRI协议将其针对碎片的DNA清除。
测序所需的设备和材料
PACBIO强烈建议使用汉密尔顿液体处理系统将DNA剪切至〜15 - 20 kb的片段尺寸范围，用于WGS样品制备工作流程。If a Hamilton system is unavailable, a Megaruptor 3 system, Spex SamplePrep 1600 MiniG homogenizer or MP Bio FastPrep 96 homogenizer may also be used to shear DNA samples.如果上述剪切工具都不可用，则Covaris g-tube提出了一种替代剪切方法，该方法不需要仪器以外的标准微分离散 - 参见技术注：Covaris G-Tube DNA剪切smrtbell Prep Kit 3.0（102-326-501），以获取更多信息。有关特定设备建议的更详细的指导，请参阅适当的PACBIO程序和清单。
DNA高灵敏度测定快速指南LabChip®GX...
1使用梯子作为TE缓冲液样品确定与DNA片段有关的所有规格。使用Covaris剪切对照基因组DNA（人类雄性）在TE缓冲液中确定与DNA涂片有关的所有规格。剪切时间为30或240。2分辨率定义为两个峰的一半高度或更好的分离。实际分离性能取决于样本和应用。峰值小于一半高度的峰仍然可以通过系统软件准确地识别。
Biomek Ngenius Illumina Trusight肿瘤学500 DNA仅自动化套件应用程序模板设置指南
Illumina Trusight肿瘤学500 DNA自动化套件应用DNA仅允许创建与Illumina测序平台兼容的库。f it tollowing批处理，可以将Covaris剪切的DNA样品加载到库制备反应容器（RV）上，并通过末端修复/A-tailing，适配器连接和索引PCR制备到Illumina库中。感兴趣的区域与探针杂交，磁捕获和洗脱，并且富集的文库被杂乱无章。可选的荧光定量步骤可用于确保在基于珠子的归一化之前有足够的库。归一化后，库准备池进行测序。下面的图1详细介绍了工作流的特定自动化和手动步骤。
DNA Sequencer Pricelist
Gel Purification 60,68 R Post PCR Clean-up 34,39 R Bead based Post PCR clean-up 43,08 R DNA sequencing reaction 105,21 R Sequencing Electrophoresis only 60,77 R Fragment Analysis run 67,65 R Use of Realtime instrument 103,69 R RT 0.1ml Fast Plate 158,97 R BigDye kit (800ul) 24 590,07 R Sequencing Buffer (800ul) 1 329,34 R Qubit assay Price on request PerkinElmer LabChip (gDNA) Price on request PerkinElmer LabChip (Fragment analysis ) Price on request TapeStation (RNA Screen tape) Price on request TapeStation (Fragment analysis - D1000) Price on request TapeStation (Fragment analysis - D5000) Price on request Covaris shearing Price on request
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环