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在胰腺癌异种移植模型中使用 Seribantumab 和 DARPin-毒素融合共同靶向 HER3 和 EpCAM 的可行性
1 乌普萨拉大学免疫学、遗传学和病理学系，瑞典乌普萨拉 751 85 2 肿瘤治疗学研究中心，化学和应用生物医学科学研究院，托木斯克国立研究型理工大学，托木斯克 634050，俄罗斯 3 俄罗斯科学院 Shemyakin-Ovchinnikov 生物有机化学研究所分子免疫学实验室，莫斯科 117997，俄罗斯 4 乌普萨拉大学药物化学系，瑞典乌普萨拉 751 23 5 乌普萨拉大学生命科学实验室，瑞典乌普萨拉 751 23 6 生物纳米光子实验室，生物医学工程物理研究所 (PhysBio)，国立研究核大学‘MEPhI’，莫斯科 115409，俄罗斯 7 谢切诺夫大学生物医学工程中心，莫斯科 119991，俄罗斯 * 通讯作者： anzhelika.vorobyeva@igp.uu.se
使用 DART-AAV 进行体内基因传递，靶向 CD8
体内基因治疗面临的最大挑战之一是载体介导高度选择性的基因转移到特定治疗相关细胞群中。我们在此介绍 DARPin 靶向 AAV（DART-AAV），展示针对人类和鼠 CD8 的 DARPin。将 DARPin 插入 AAV2 和 AAV6 衣壳蛋白 1（VP1）的 GH2/GH3 环中，可实现对 CD8 阳性 T 细胞的高选择性，同时基因传递活性不受影响。值得注意的是，衣壳核心结构未发生改变，突出的 DARPin 可检测到。在复杂的原代细胞混合物中，包括供体血液或小鼠全身注射，CD8 靶向 AAV 在选择性、靶细胞活力和基因转移率方面远远优于未改造的 AAV2 和 AAV6。在体内，将单个载体注射到经过条件化的人源化或免疫功能正常的小鼠中，可击中高达 80% 的活化 CD8+ T 细胞。虽然在非活化条件下基因转移率显著降低，但在将 Cre 递送到指示小鼠中时，仍然可以检测到 CD8+ T 细胞中的选择性基因组修饰。在两种小鼠模型中，CD8+ T 细胞的选择性接近绝对，但肝脏的靶向性极强。本文描述的 CD8-AAV 扩展了免疫学研究和体内基因治疗选择的策略。
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补充说，DARPIN包含一个精心的白蛋白域，该域设计用于调整其半衰期。在体外测定中，使用CD47竞争和CD47/SIRPα抑制进行了有条件阻断C-KKIT+目标细胞上CD47的能力。功能活性
合成与系统生物技术
药物输送系统 (DDS) 的发展已导致用于治疗和检测各种疾病的疗法越来越有效。DDS 使用一系列由聚合物或无机材料（例如胶束、金属和聚合物纳米颗粒）制成的纳米级输送平台，但它们的不同化学成分会改变其大小、形状或结构，而这些结构本身就很复杂。基因编码的蛋白质纳米笼是非常有前途的 DDS 候选物，因为它们具有模块化组成、易于在各种宿主中重组生产、可控制货物分子的组装和装载以及可生物降解性。天然存在的纳米隔室的一个例子是包囊蛋白，这是最近发现的细菌细胞器，已被证明可以重新编程为纳米生物反应器和疫苗候选物。在这里，我们报告了基于海栖热袍菌包囊蛋白的靶向 DDS 平台的设计和应用，该平台经过重新编程以在外表面显示一种称为设计锚蛋白重复蛋白 (DARPin) 的抗体模拟蛋白并封装细胞毒性有效载荷。本研究选择的 DARPin9.29 可特异性结合乳腺癌细胞上的人表皮生长因子受体 2 (HER2)，体外细胞培养模型已证明这一点。通过将封装蛋白-DARPin9.29 融合蛋白与工程黄素结合蛋白微型单线态氧发生器 (MiniSOG) 从大肠杆菌中的单个质粒共表达，可在体内一步组装基于封装蛋白的 DDS。纯化的封装蛋白-DARPin_miniSOG 纳米隔室可特异性结合 HER2 阳性乳腺癌细胞并引发细胞凋亡，表明该系统具有功能性和特异性。DDS 是模块化的，可以利用 DARPin 筛选库形成多受体靶向系统的基础，允许使用具有已知特异性的新 DARPin，并通过封装蛋白货物装载机制已证实的灵活性，允许选择所需的货物蛋白。
daratumumab的改进
多发性骨髓瘤（MM）进展紧密取决于骨髓（BM）微环境的细胞，包括成纤维细胞（FBS）和免疫细胞。在其BM利基市场中，MM细胞粘附于FBS维持免疫逃避，耐药性和被称为最小残留疾病（MRD）的肿瘤细胞的不可检测的耐力。在这里，我们描述了新型的双特异性ANKYRIN重复蛋白（DARPIN）α-FAPX4 - 1BB（MP0310）具有FAP依赖性4 - 1BB激动活性。α-FAPX4 - 1BB DARPIN同时与FAP结合，分别与活化的FBS和免疫细胞过表达4 - 1BB。尽管流式细胞仪分析表明，来自MM患者的T和NK细胞未被激活，未表达4 - 1BB，用daratumumab或daratumumab或Elotuzumab刺激，单克隆抗体（MABS）目前用于治疗MM的抗体（MABS），在MM中均为4 - 1BB均在MM基于MM基于MM的患者中，均为4 - 1BB。mAb诱导的4 - 1BB过表达允许α-FAPX4 - 1BB的参与，该α -FAPX4 - 1BB充当FAP + FBS和4 - 1BB + NK细胞之间的桥梁。因此，α-FAPX4 - 1BB增强了通过改善CD107A和Perforin的释放，通过改善CD107A和Perforin的释放，增强了daratumumab处理的NK细胞的粘附，因此通过抗体介导的细胞毒性细胞毒性（ADCC）来杀死MM细胞。有趣的是，在FBS存在的情况下，α -FAPX4 - 1BB显着增强了daratumumab-介导的ADCC，这表明它可能会克服BM FBS的免疫抑制EF EF EFT。总体而言，我们推测，用α-FAPX4 - 1BB治疗可能代表着一种有价值的策略，可以通过消除潜在的MRD细胞来改善MM患者的mab诱导的NK细胞活性。
通过设计分子大小和半衰期来优化蛋白质-药物偶联物的抗肿瘤功效
尽管一些抗体-药物偶联物已获批用于癌症治疗，但它们的临床成功率并不令人满意，因为治疗窗口非常小，受偶联物和释放毒素的靶向和脱靶毒性影响。因此，必须探索具有系统研究的分子参数的其他形式以增加其治疗窗口。在这里，我们专注于有效分子量。为了生成具有精确定义的药物载量和可调药代动力学的偶联物，我们使用设计的锚蛋白重复蛋白 (DARPins)，与不同长度的非结构化多肽融合，以产生具有任何所需半衰期的蛋白质，以确定具有最佳疗效的蛋白质。我们生成了一种 EpCAM 靶向 DARPin-MMAF 偶联物，与不同长度的 PAS 或 XTEN 融合，以及一系列匹配的非结合 DARPin 对照，以解释增强的渗透性和保留 (EPR) 效应，在小鼠中的半衰期覆盖从几分钟到 20.6 小时。所有结合物均以高纯度生产，在人类肿瘤细胞培养中表现出高特异性和细胞毒性，IC 50 值在低 nM 范围内，与多肽类型和长度无关。由于其纯化更简便，PASylated 结合物在携带 HT29 肿瘤异种移植的裸鼠中进行了测试。无论其大小如何，所有 PASylated 结合物在以 300 nmol/kg 重复全身给药后均具有良好的耐受性。我们发现具有中等大小和半衰期的结合物表现出最强的抗肿瘤作用，并推断这种作用是血清半衰期和肿瘤内扩散的折衷，因为结合率和亲和力基本相同，而外渗仅起很小的作用。