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利用 CRISPR 干扰技术高效、快速地灭活核梭杆菌的基因
摘要 通过在具核梭杆菌中创建框内缺失突变来使基因失活非常耗时，并且大多数具核梭杆菌菌株在遗传上是难以处理的。为了解决这些问题，我们引入了一种基于核糖开关的可诱导 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 系统。该系统采用核酸酶失活的化脓性链球菌 Cas9 蛋白 (dCas9)，通过持续表达的单向导 RNA (sgRNA) 特异性地引导至目的基因。从机制上讲，这种 dCas9-sgRNA 复合物成为 RNA 聚合酶难以逾越的障碍，从而抑制了目标基因的转录。利用这个系统，我们首先研究了两个非必需基因 ftsX 和 radD，它们对于具核梭杆菌的胞质分裂和共聚集至关重要。添加诱导剂茶碱后，ftsX 抑制导致类似于染色体 ftsX 缺失的丝状细胞形成，而靶向 radD 则显著降低 RadD 蛋白水平，消除 RadD 介导的共聚集。随后将该系统扩展到探测必需基因 bamA 和 ftsZ，这两个基因对于外膜生物合成和细胞分裂至关重要。令人印象深刻的是，bamA 抑制破坏了膜完整性和细菌分离，阻碍了生长，而 ftsZ 靶向会在肉汤中产生细长的细胞，并且琼脂生长受到损害。对 F. nucleatum 临床菌株 CTI-2 和 Fusobacterium periodonticum 的进一步研究表明，靶向 tnaA 时吲哚合成减少。此外，沉默 F. periodonticum 中的 clpB 会降低 ClpB，从而增加热敏感性。总之，我们的 CRISPRi 系统简化了各种梭杆菌菌株的基因失活。
在微生物 CRISPR 干扰中使用缩短和随机 sgRNA 文库筛选新靶基因
摘要：CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选已用于使用单分子向导 RNA（sgRNA）文库识别与特定表型相关的靶基因。在 CRISPRi 筛选中，包含原始靶标识别序列的随机 sgRNA 文库的大小很大（∼ 10 12 ）。在本文中，我们证明 sgRNA 中的靶标识别序列（TRS）的长度可以从原来的 20 个核苷酸（N 20 ）缩短到 9 个核苷酸（N 9 ），这仍然足以使 dCas9 抑制大肠杆菌木糖操纵子中的靶基因，无论其与启动子还是开放阅读框区结合。基于结果，我们构建了 TRS 长度 5′ 缩短的随机 sgRNA 质粒文库，并通过对从 Xyl − 表型细胞中纯化的 sgRNA 质粒进行桑格测序来识别木糖代谢靶基因。接下来，利用随机 sgRNA 文库筛选靶基因，以增强合成大肠杆菌细胞中紫色素的产生。通过分析深紫色菌落中 sgRNA 质粒中的 TRS 冗余度，选择了 17 个靶基因。其中，已知有 7 个基因（tyrR、pykF、cra、ptsG、pykA、sdaA 和 tnaA）可增加细胞内 L-色氨酸池（紫色素的前体）。17 个细胞中每个靶基因有一个缺失，紫色素的产量显著增加。这些结果表明，使用缩短的随机 TRS 文库进行 CRISPRi 可以简单且经济高效地进行基于表型的靶基因筛选。关键词：CRISPR 干扰、失活 Cas9、随机文库、缩短的 sgRNA、靶标识别序列、紫色素、基于表型的靶标筛选■简介
血脑屏障的生物学和模型在CRISPR中完善定位
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) is a natural bacterial defense system against bacteriophage infection that has recently been harnessed for genome and tran- scriptome editing in a wide range of organisms based on the generation of double-strand DNA breaks (DSBs) and RNA cleavage (3, 24, 32, 47, 52, 58, 73, 76, 79, 91，127）。是根据工程II（CAS9）和VI型（CAS13）可编程核酸酶，DNA和RNA基础编辑，质量编辑以及CRISPR干扰/激活（CRISPRI/A）编辑（CRISPRI/A）编辑（CRISPRI/A）编辑，启用与基本疾病的校正和安装基本疾病的校正和安装，40个基本疾病的突变（30; 69–71、87、105、115、135），例如转录扰动（138）和表观遗传调节（94）。这些基于DNA的编辑器是通过没有DSB活性的死亡CAS9（DCAS9）或CAS9 Nickase（CAS9N）的融合而生成的，只有对胞嘧啶脱氨酶的活性（例如，APOBEC和C-TO-T编辑的APOBEC和辅助）或trans-FER RNA（TRNA）腺苷（TRNA）腺苷氨基氨基酶（例如，tada）（例如，tada）（37）（37）（37）（37）。RNA编辑系统是通过将DCAS13B/DCAS13D/DCAS13X融合而成的，没有RNA裂解活性与腺苷脱氨酶结构域（例如，ADAR2 DD用于A-TO-I编辑）或工程型胞质Deam-Inase Inase Insaine（例如，ADAR2DD）的87，C-TON 7，c-us-n.7，c.-ty 7，c c. 47，c. 47，c.-ty 7，c-ty 7，c-ty 7，c-us-c.-edy in 13，c-u-u--u-u-udy in 13，c-u-udy in 34，c-u-u--为了启用序列特异性基因组调节，DCAS蛋白还融合到多个基因调节效应子，例如逆转录酶（10），转录阻遏物和激活剂（40，101）和表观遗传性调节器（17，99）。
图书馆对 CRISPR-CAS 的使用进行审查......
简介：抗生素耐药性是一个全球性问题，由于过度和不合理使用抗生素，杀死了体内的致病细菌和正常菌群。这会导致对多种抗生素产生多重耐药性的细菌的形成。世卫组织估计，全球因抗生素耐药性造成的死亡人数已达每年70万，医疗机构用于克服抗生素耐药性的成本估计每年约为15亿美元。除了抗生素之外，还可以应用许多创新疗法来对抗 AMR（抗菌素耐药性）细菌，例如 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列），它已被证明可用于针对致病细菌的基因，例如编码生物膜形成、毒力因子或特别是抗菌素耐药性的基因。该药物靶点较强且不影响其他正常菌群，因此可以作为治疗抗生素耐药性疾病的主要选择。讨论：文献研究表明，CRISPR 疗法伴随 CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）已被证明能够通过切割在毒力因子、代谢和抗菌素耐药性酶中发挥作用的基因（例如 bla、sul2 和 mcr-1 基因）在体内和体外进行基因组编辑，从而可以消除金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和藻类希瓦氏菌等耐药细菌，或使其再次对在进行 CRISPR 疗法之前最初给予的抗生素变得敏感。 CRISPR-Cas9还可以通过将Cas9修饰为dCas9来激活或抑制基因表达，起到基因表达控制器的作用，可以作为FLASH方法中的应用，用少量样本检测序列。结论：因此，基于 Cas9 的 CRISPR 疗法有可能成为抗菌素耐药性治疗的主要手段。关键词：CRISPR-Cas9、感染、抗生素耐药性
改进高粱转化和基因组编辑，开发稳定品系，用于光合和水分利用效率分析
通过使用基因组编辑和稳定植物转化技术，开发将高粱基因与表型联系起来的基因组水平知识库以实现生物能源目标，对于理解基本生理功能和作物改良至关重要。我们与参与该项目的各个实验室一起贡献中央枢纽能力，以创建、测试和培育转基因和基因组编辑植物。我们已经建立了可靠的协议，用于通过农杆菌介导将实验性遗传构建体引入高粱 cv BTx430，并合作生成该项目正在进行的研究所需的可行转基因。这些实验包括：； (1) 用于敲低的高粱 RNAi 构建体，例如电压门控氯离子通道蛋白、α碳酸酐酶 7 (CA) 和 9-顺式环氧胡萝卜素双加氧酶 4 以及 myb 结构域蛋白 60； (2) 构建体用于测试磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC) 启动子表达、CA 过表达和具有改变动力学的 PEPC 的保真度；(3) 旨在测试一系列增加的叶肉 CA 活性的 CA 过表达的其他版本；(4) Ta Cas 9、dTa Cas9 和 dCas9 转录激活因子用于改进编辑，以及；(5) 构建体用于评估转基因过程的改进，旨在增加转化频率并缩短 T1 种子的时间。这些品系目前处于转基因过程的不同阶段。使用形态发生调节剂介导的转化 (MRMT) 的最新发展是实现快速转化和基因组编辑的突破。我们报告了一种使用 MMRT 技术的改进的快速转化方法的开发，该方法有可能增加我们的项目的吞吐量并缩短时间。与 Voytas 实验室合作，我们评估了 MRMT 载体的公共版本。 Voytas 实验室还在测试递送基因组编辑试剂的新方法，特别是使用 RNA 病毒载体通过感染递送 gRNA。通过感染进行可遗传基因编辑已在多个双子叶植物中实现，我们正在努力在狗尾草和高粱中实施该技术。
crispri：基于结核病药物靶标和微晶纤维素增强药物递送的基于持续治疗功效的识别
ElenaFernándezTorres摘要结核病（TB）仍然是全球重大的健康挑战，由于多药耐药性结核分枝杆菌（MTB）的兴起而加剧。由于抗性机制而导致的现有药物的效率低下需要新颖的药物靶标和优化的药物输送系统。这项研究旨在使用CRISPR干扰（CRISPRI）筛查确定MTB中的必要药物靶标，并评估基于微晶纤维素（MCC）的配方效应以持续药物递送。使用DCAS9介导的转录抑制构建了一个基因组 - 宽CRISPRI文库，并使用qPCR和RNA测序（RNA-Seq）评估了基因敲低效率。使用肉汤稀释测定法和菌落形成单位（CFU）枚举评估了基因抑制对细菌存活和药物敏感性的影响。基于MCC的Isoniazid制剂是使用湿的颗粒方法开发的，并通过扫描电子显微镜（SEM），X射线衍射（XRD）和傅立叶变换红外光谱（FTIR）来表征。使用USP溶解设备II评估了体外药物释放曲线，并进行了统计分析，包括ANOVA和Pearson相关性，以确定重要的趋势。结果表明，高CRISPRI敲低效率与降低的细菌存活率相关（r = -0.78，p <0.0001），表明成功鉴定了基本基因。细菌存活与利福平MIC之间的正相关（r = 0.61）证实，敲低会影响药物敏感性。基于MCC的制剂显示在24小时内持续释放药物，在MCC药物释放和细菌存活之间存在很强的负相关（-0.68），证实了延长的抗菌活性。该研究得出结论，CRISPRI是结核病药物靶标识别的有力工具，而基于MCC的配方为持续药物递送提供了有希望的策略。未来的研究应在体内药代动力学，全基因组测序和先进的药物携带者中整合，以进一步优化结核病治疗策略。关键字：结核病，CRISPR干扰，结核分枝杆菌，基因敲低，细菌存活，微晶纤维素，耐药性，持续药物释放，药物释放，精确药物，精密医学引起的结核病（TB），由Mycobacterium witter（Mimabacterium witter）造成了1.超过100个全球的造成（Mimobacterium witter and Fresprim andim Million Millionb）（Mim Million Millionb），是一个1. Mimb）。每年死亡（Samukawa等，2022）[1]。耐多药（MDR-TB）和广泛的耐药性结核（XDR-TB）的出现增加了对新型治疗策略的迫切需求（Cheung等，2021）[3]。传统的药物发现方法由于细菌代谢，休眠机制和内在耐药性的复杂性而难以确定新的有效靶标（Rock等，2016）[2]。在响应中，CRISPR干扰（CRISPRI）技术已成为鉴定和验证细菌生存，耐药性和代谢脆弱性所需基因基因的革命性工具（Yan等，2022）4 []。CRISPRI利用催化死亡的CAS9（DCAS9）酶选择性地抑制基因表达而无需诱导双链断裂，从而在活细菌细胞中实现了高通量药物靶标筛查（McNeil等人，2021年）[3]。虽然CRISPRI已广泛用于癌症研究和细菌遗传学，但通过鉴定出新的可药物靶标和抗生素协同作用来增强结核病药物发现的潜力仍未得到充分激发（Choudhery等，2024）[5]。除了确定新药靶标外，改善药物输送系统对于增强治疗功效和患者依从性至关重要（Kalita等，2013）[6]。当前的结核病药物治疗方案很长（6-9个月），导致辍学率高，治疗不完全，
靶向染色质编辑揭示的模拟表观遗传记忆
图 2. DNMT3A 编辑细胞中的基因表达动态表明了一种不同于二进制的记忆形式。A 使用与 dCas9、PhlF 或 rTetR 融合的 KRAB、DNMT3A 或 TET1 作为 DNA 结合域 (DBD) 进行瞬时表观遗传编辑的概述。B 本研究开发的实验系统示意图。报告基因通过位点特异性染色体整合整合到内源性哺乳动物基因座中。哺乳动物组成型启动子 (EF1a) 驱动荧光蛋白 EBFP2 的表达。上游结合位点能够靶向募集表观遗传效应物，这些效应物与 DNA 结合蛋白 rTetR、PhlF 或 dCas9 融合。报告基因两侧是染色质绝缘体，以与其他基因隔离。 C 实验概述描述了瞬时转染到带有报告基因的细胞、基于转染水平的荧光激活细胞分选和时间过程流式细胞术测量。D 根据图 C 中显示的实验时间线，DNMT3A 编辑（DNMT3A-dCas9）报告基因的基因表达动态。显示的是 DNMT3A 编辑细胞的单细胞流式细胞术测量（EBFP2）。DNMT3A-dCas9 靶向启动子上游的 5 个靶位点，并使用乱序 gRNA 靶序列作为对照（图 SE.2 A、B、表 S3）。黄色阴影表示检测到转染标记的时间。显示的数据来自 3 个独立重复的代表性重复。E 转染 DNMT3A-dCas9 和细胞分选后 14 天进行 MeDIP-qPCR 和 ChIP-qPCR 分析，以获得高水平的转染。分析了启动子区域（表 S4 和方法）。显示的数据来自三个独立的重复。报告的是使用标准 ∆∆ C t 方法相对于活性状态的倍数变化及其平均值。误差线是平均值的标准差。DNMT3A-dCas9 靶向启动子 (gRNA) 上游的 5 个靶位点。使用乱序的 gRNA 靶序列 (gRNA NT) 作为对照。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，非配对双尾 t 检验。F 根据图 C 中显示的实验时间线的 KRAB 编辑 (PhlF-KRAB) 基因表达动态。显示的是单个细胞的报告基因 (EBFP2) 的流式细胞术测量值。黄色阴影区域表示在未应用 DAPG 期间检测到转染标记的时间。从第 6 天开始，在 PhlF-KRAB 和 PhlF 条件下应用 DAPG。每天测量不同的独立重复。显示的数据来自 3 个独立重复。G 转染 PhlF-KRAB 和高水平转染细胞分选后 6 天的 MeDIP-qPCR 和 ChIP-qPCR 分析。分析的是启动子区域。数据来自三个独立重复。显示的是相对于活性状态的标准 ∆∆ C t 方法确定的倍数变化及其平均值。误差线是平均值的标准差。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，非配对双尾 t 检验。H 当 KRAB = 0、TET1 = 0 时获得的染色质修饰回路。参见 SI 图 SM.1 C。I 上图：(CpGme, X) 对的剂量反应曲线。下图：DNMT3A 脉冲强度与 DNA 甲基化等级 (CpGme) 之间的剂量反应曲线。脉冲强度通过增加其高度来增加。参见 SI 图 SM.1 D 和 SM.3。J 系统基因表达的平稳概率分布，由 SI 表 SM.1 和 SM.4 中列出的反应表示，参数值在 SI 第 S.9.3 节中给出。K 系统在 t = 28 天后的基因表达概率分布，如图 J 所示，参数值和初始条件在 SI 第 S.9.4 节中给出。参见 SI 图 SM.1 B 和 SM.2。在图 I 和 J 中，DNMT3A 动力学被建模为随时间呈指数下降的脉冲（参见第 S.1.1 节 - SI 方程 (SM.7)）。在我们的模型中，ε (ζ) 是衡量基础（招募）擦除率与每次修饰的自催化率之间比率的参数。参见 SI 图 SM.1 E 和 SM.3。
干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活
研究文章 胱天蛋白酶对不同 DNA 底物的整合可通过与 Cas9 融合在体外靶向 R 环
CRISPR 系统通过 Cas1–Cas2 蛋白复合物催化的 DNA 捕获和整合建立针对移动遗传元件的适应性免疫。最近的研究表明，CRISPR 重复序列和适应模块起源于一种称为 Casposons 的新型 DNA 转座子。Casposons 编码一种称为 Casposase 的 Cas1 同源物，它单独整合到含有来自 Casposons 的末端倒置重复序列 (TIR) 的靶分子单链和双链 DNA 中。最近的一项研究表明，Methanosarcina mazei casposase 能够整合随机 DNA 寡核苷酸，在本研究中我们使用了 Acidoprofundum boonei casposase，从中我们还观察到了混杂的底物整合。在这里，我们首先表明 Acidoprofundum boonei casposase 的底物灵活性扩展到没有 TIR 的 DNA 随机整合，包括功能基因的整合。然后，我们利用这一点研究将casposase催化的DNA整合反应靶向特定的DNA位点，从而允许插入特定的DNA有效载荷。Casposase-Cas9融合蛋白经过设计，在体外具有催化能力，可以从短合成DNA或基因（有或没有TIR）生成RNA引导的DNA整合产物。然而，由于casposase部分的竞争性背景活性，DNA整合仍可能在无人引导的情况下发生。Casposase-dCas9在大肠杆菌细胞中的表达有效地靶向了染色体和质粒lacZ，这通过降低的β-半乳糖苷酶活性显示出来，但未检测到DNA整合。casposase的混杂底物整合特性使其成为潜在的DNA插入工具。Casposase-dCas9融合蛋白可以作为开发不依赖于同源性指导的DNA修复的DNA插入基因编辑的原型。
光活化的DCAS9-实际融合蛋白的位点特异性靶向产生氧化DNA损伤的瞬时局部区域
DNA修复需要对局部染色质结构进行重组，以促进并修复DNA。研究特定染色质结构域中的DNA双链断裂（DSB）修复已通过使用序列特异性核酸内切酶产生焦油的断裂来帮助。在这里，我们描述了一种结合Killerred的新方法，该方法是一种光敏剂，该光敏剂在暴露于光线时会产生活性氧（ROS），以及CRISPR/CAS9系统的基因组侵蚀性。将Killerr的融合到催化无效的CAS9（DCAS9）产生DCAS9-KR，然后可以将其靶向具有适当的指导RNA的任何所需的基因组区域。用绿光激活DCAS9-KR会产生活性氧的局部增加，从而导致“聚集”的氧化损伤，包括DNA断裂和碱基损伤。迅速（几分钟之内）激活DCAS9-KR会增加γH2AX和KU70/80复合物的募集。重要的是，这种损害在终止光线暴露后的10分钟内修复，表明DCAS9-KR产生的DNA损伤既快速又瞬时。此外，维修是专门通过NHEJ进行的，没有基于HR的机制可检测到的贡献。令人惊讶的是，修复的DNA损伤区域的测序没有发现目标区域中突变或indels的增加，这意味着NHEJ在低水平的条件下具有高忠诚度，损害有限。DCAS9-KR用于产生靶向损伤的方法与使用核酸内切酶相比具有很大的优势，因为可以通过控制光线暴露来控制DNA损伤的持续时间和强度。此外，与进行多个切割修复周期的核核酸酶不同，DCAS9-KR会产生一系列的损害，更类似于在急性暴露于活性氧或环境毒素中急性暴露时造成的损害类型。DCAS9-KR是一个有前途的系统，可在聚类的DNA病变上诱导DNA损伤并测量位点特异性修复动力学。