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基于 dCas9 的模块化组合表观基因组编辑招募平台
摘要 基于 CRISPR-dCas9 的靶向表观基因组编辑工具可实现对各种基因组修饰的精确操作和功能研究。然而，这些工具通常表现出相当大的上下文依赖性，靶基因和细胞类型之间的功效差异很大，这可能是由于染色质修饰的潜在差异造成的。虽然同时招募多个不同的“效应子”染色质调节剂可以提高功效，但这些系统通常无法控制哪些效应子结合及其空间组织。为了克服这个问题，我们创建了一个新的模块化组合表观基因组编辑平台，称为 SSSavi。该系统充当与 dCas9 融合的可互换和可重新配置的对接平台，可同时招募多达四种不同的效应子，从而可以精确控制和重新配置效应子组成及其结合的空间顺序。我们展示了 SSSavi 系统的活性和特异性，并将其与现有的多效应子靶向系统进行比较，以确定其功效。此外，通过改变效应子募集的空间顺序，在多个靶基因和细胞系中，我们证明了效应子募集顺序对于有效转录调控的重要性。总之，该系统提供了探索效应子共同募集到特定位点的能力，从而可能增强对之前对靶向表观基因组编辑有抵抗力的染色质环境的操纵。
使用CAS9或DCAS9靶向常染色体ceratis capitata变压器基因，以使XX个体成为男性化的XX个体，而无需诱导突变
背景：地中海果蝇的女性Capitata（Medfly）是主要的农业害虫，因为它们将鸡蛋放入数百种植物的水果作物中。在Medfly中，女性确定是基于CCTRANSFORMER（CCTRA）的激活。CCTRA的母体贡献是需要在XX胚胎中激活CCTRA，并通过女性特异性的替代剪接来开始和表观上保持CCTRA阳性反馈回路，从而导致女性发育。在XY胚胎中，确定雄性基因（MOY）的雄性阻断了这种激活，CCTRA会产生编码截短的CCTRA同工型和男性分化的男性特异性转录本。结果：为了诱导第一个编码外显子中的移码突变，以破坏女性特异性和较短的男性特异性CCTRA开放式阅读框（ORF），我们在胚胎中注射了Cas9核糖核蛋白（Cas9和单个指导RNA，SGRNA，SGRNA，SGRNA，SGRNA）。由于这种方法大多导致单相关突变，因此在携带双重突变的G 1 XX个体中，男性化才预计，在G 0注射个体的交叉之后。令人惊讶的是，这些注射仅XX胚胎导致了G 0成人，不仅包括XX女性，还包括50％的肥沃XX雄性。G 0 XX雄性表达男性特异性CCTRA转录本，表明完全男性化。有趣的是，在六个G 0 XX男性中，有四个显示了CCTRA野生型序列。这一发现表明，Cas9-SgrNA注射的男性化与其诱变活性无关。与这种观察结果一致，通过死亡的Cas9（酶促无活性，DCAS9）将CCTRA的胚胎靶向XX胚胎，也有利于胚胎和成人中CCTRA的男性特异性剪接。
第4章通过技术中的植物中的基因表达调制CRISPR/DCAS9
在近几十年内，涉及DNA精确操纵的核酸酶的技术已经发生了深刻的进步，成为了诱导音节突变的有希望的替代方法，并且对基因表达的薄而控制。是基因组编辑，例如核酸酶锌指（锌指核酸酶），具有转录本激活型效应的数字（Talens，英语转录本类核酸酶），以及最近的CRISPR/CAS技术（来自英语粘膜调节性调节性的短与核酶壳相关）。后者具有其革命性，尤其是为了缘故，普遍性和相对简单性（Pickar-Oliver； Gersbach，2019年）。此外，CRISPR/CAS是一种灵活的工具，需要进行修改，这有助于其持续的改进并多样化其在细胞功能和生物技术中的应用。
基于 CRISPR/dCas9 的系统：植物科学中的机制和应用
摘要：RNA 引导的基因组转录调控工具，即成簇的规律间隔短回文重复序列干扰 (CRISPRi) 和 CRISPR 介导的基因激活 (CRISPRa)，是基因功能研究的强大技术。这两个系统都源自 CRISPR/Cas9 系统，由催化失活的 Cas9 (dCas9)、转录效应物和单个引导 RNA (sgRNA) 组成。这种类型的 dCas9 无法切割 DNA，但保留了其特异性结合 DNA 的能力。dCas9/sgRNA 复合物与靶基因的结合导致转录干扰。CRISPR/dCas9 系统已被探索作为转录调控和基因组成像的工具。尽管 CRISPR/dCas9 系统具有潜在的应用和优势，但它也面临诸多挑战和限制，包括脱靶效应、原间隔区相邻基序 (PAM) 序列要求、高效的递送方法以及 CRISPR/dCas9 干扰作物在多个国家被标记为转基因生物。本综述重点介绍了 CRISPR/dCas9 技术的进展及其在作物改良中的应用和潜在挑战。
神经元中用于基因表达调控的CRE依赖性CRISPR/DCAS9
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补充信息
名称t-测试注释RNP1：全长t（2）= 7.03，p = 0.0023显着不同的RNP1：GQ Stall t（2）= 18.39 = 18.39，p <0.001 p <0.001 rnp1：dcas9 stall t（2）= 22.13，p <0.001显着不同，p <0.001显着不同的rnp2：pefly rnp2：pull Rnp2：2）= 2） RNP2：GQ Stall t（2）= 22.47，p <0.001显着不同的RNP2：DCAS9 Stall t（2）= 15.14，p <0.001，p <0.001显着不同的RNP3：全长t（2）= 9.88，p <0.001显着不同（2）= 21.36，p <0.001显着不同的RNP4：全长t（2）= 16.93，p <0.001显着不同的RNP4：GQ Stall t（2）= 16.56 = 16.56，p <0.001显着不同的RNP4：DCAS9 Stall T（DCAS9 Stall T（2）= 20.27，P <0.001 = 20.27，p <0.001 = 20.001 = 2 Fulter T（2） p <0.001显着不同的RNP5：GQ失速t（2）= 24.08，p <0.001显着不同的RNP5：DCAS9 Stall t（2）= 18.06 = 18.06，p <0.001显着不同的RNP6：全长T（2）显着t（2）= 3.38，p <0.001显着不同的RNP6：p <0.001 = 0.001 = 0.001 = 12.59，= 1.59，= 12.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5.5。 RNP6：DCAS9 Stall t（2）= 28.39，p <0.001显着不同的RNP7：全长t（2）= 6.53，p = 0.0028显着不同的RNP7：GQ Stall t（2）= 20.38，p <0.001，P <0.001显着不同的RNP7：dcas9 stall talp7：dcas9 stall tall t dive <0.00.00.93 = 27.93
对基于 CRISPR 的转录激活因子进行系统比较，揭示增强子-启动子相互作用的基因调控特征
基于核酸酶失活 CRISPR/Cas (dCas) 的系统已成为一种强大的技术，可以综合重塑人类表观基因组和基因表达。尽管这些平台的采用越来越多，但它们的相对效力和机制差异尚未完全表征，特别是在人类增强子-启动子对中。在这里，我们系统地比较了最广泛采用的基于 dCas9 的转录激活因子，以及由与人类 CBP 蛋白催化核心融合的 dCas9 组成的激活因子，以及人类增强子-启动子对。我们发现这些平台在不同人类细胞类型中显示出不同的相对表达水平，并且它们的转录激活效率因效应域、效应子募集结构、靶位点和细胞类型而异。我们还表明，每种基于 dCas9 的激活剂都可以诱导增强子 RNA (eRNA) 的产生，并且这种 eRNA 诱导与同源启动子的下游 mRNA 表达呈正相关。此外，我们使用基于 dCas9 的激活剂来证明人类增强子和启动子之间可以存在内在的转录和表观遗传互惠性，并且可以通过将基于 dCas9 的转录激活剂靶向增强子来合成驱动增强子介导的下游启动子的追踪和参与。总之，我们的研究为增强子介导的人类基因表达控制和基于 dCas9 的激活剂的使用提供了新的见解。
CRISPR介导的转录抑制作用弓形虫Gondii
用于调整内源基因表达的抽象工具是确定各种细胞表型的遗传基础的关键。尽管在弓形虫中可以使用合成的可调节性，但基因表达的靶向和组合下调的可扩展方法（如RNA干扰）尚未得到发展。为了研究CRISPR介导的转录调控的可行性，我们研究了来自甲状腺链球菌和嗜热链球菌的两个催化无活性Cas9（DCAS9）直系同源物的功能。在添加靶向启动子的单个指定RNA（SGRNA）和表面抗原基因SAG1的5 9个未翻译区域（UTR）后，我们对靶基因的蛋白质刺激蛋白质的变化通过流量细胞仪的蛋白质刺激变化，用于转录报告基因和immu-immu-nosu-nosu-noce。我们发现DCAS9直系同源物产生了一系列靶基因表达水平，并且抑制程度持久且稳定地遗传。因此，化脓性链球菌和嗜热链球菌DCAS9可以有效地产生弓形虫中的基因表达水平。两个DCAS9的独特的SGRNA支架要求允许通过转录调制，基于显微镜的研究标记或其他基于DCAS9的方法同时检查两个不同的基因座。利用新近获得的基因组转录起始站点数据，这些工具将有助于开发弓形虫的新功能筛查方法。
遗传学 利用 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在哺乳动物细胞和小鼠中产生精确的大片段缺失
目前，Cas9 和 Cas12a 系统被广泛用于基因组编辑，但它们精确产生大片段染色体缺失的能力有限。I-E 型 CRISPR 介导广泛和单向的 DNA 降解，但迄今为止，控制 Cas3 介导的 DNA 缺失的大小已被证明是难以捉摸的。在这里，我们证明了 Cas9 的内切酶失活 (dCas9) 可以精确控制哺乳动物细胞中 Cas3 介导的大片段缺失。此外，我们分别报告了使用 CRISPR/Cas3 和 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在小鼠中消除 Y 染色体和精确保留 Sry 基因。总之，dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 介导的精确大片段缺失为通过染色体消除建立动物模型提供了一种方法。该方法也有望成为治疗涉及额外染色体的片段突变或人类非整倍体疾病的潜在治疗策略。
使用 CRISPR 干扰和扩展的 PAM 序列来调节微生物代谢率
基因组编辑 CRISPR/Cas9 技术已导致人工转录抑制因子（也称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi)）的开发。由 crRNA 引导的失活 Cas9 (dCas9) 蛋白可以特异性地结合靶 DNA 序列，包括启动子和操纵子，而不会切割 DNA。原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列依赖性在靶向特异性 CRISPRi 的设计中可能是不利的，因为 PAM 序列对于 CRISPR/Cas9 系统的 DNA 切割至关重要。我们在 L-阿拉伯糖诱导的 P BAD 启动子的控制下，在大肠杆菌中构建了一个染色体整合的 dCas9 系统 (1 araBAD : dcas9)。将携带各种 crRNA 的质粒转化到表达 dCas9 的大肠杆菌中，这些 crRNA 具有针对 gal 启动子（-10 区域）和 gal 操纵子中的 galETK 结构基因的靶序列。在有或没有无偿 L-阿拉伯糖的情况下监测细胞生长和/或半乳糖代谢率。靶向转录延长会部分减缓 D-半乳糖消耗和细胞生长，但靶向转录起始会完全抑制 D-半乳糖消耗和细胞生长。此外，RT-qPCR 分析表明，具有几种修饰 PAM 序列的 CRISPRi 可以抑制靶 DNA 的转录。这些结果表明，可以通过使用 CRISPRi 靶向结构基因或调控区域来控制细胞代谢率和细胞生长；此外，松散的 PAM 序列依赖性可以扩展 CRISPRi 的 DNA 靶标。