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dCas9-VP64 变体与介导 CRISPR 激活的多重引导 RNA 的比较分析
CRISPR/Cas9 介导的转录激活 (CRISPRa) 是研究复杂生物现象的有力工具。尽管基于 VP64 转录激活因子的 CRISPRa 方法已在培养细胞和动物模型中得到广泛研究，并且对体内各种细胞类型和发育阶段表现出极大的通用性，但不同的 dCas9-VP64 版本尚未进行严格比较。在这里，我们比较了相同环境下的不同 dCas9-VP64 构建体（包括所用的细胞系和转染条件）激活内源和外源基因的能力。此外，我们研究了将 VP64 添加到基于 VP64 和 p300 的构建体的最佳方法。我们发现 MS2-MCP 支架 VP64 比直接将 VP64 融合到 dCas9 的 N 端更好地增强了基础 dCas9-VP64 和 dCas9-p300 活性。对于所有测试的靶基因，dCas9-VP64+MCP-VP64 和 dCas9-p300+MCP-VP64 均优于 VP64-dCas9-VP64。此外，使用 dCas9-VP64+MCP-VP64 或 dCas9-p300+MCP-VP64 进行多重 gRNA 表达可显著增强内源基因激活，达到与使用单个 gRNA 的 CRISPRa-SAM 相当的水平。我们的研究结果表明 dCas9-VP64 CRISPRa 系统有所改进，有助于开发多功能、高效的 CRISPRa 平台。
CRISPR/CAS9的基因组编辑工具箱，用于拟南芥
CRISPR/CAS9系统已成为一种强大的基因组工程工具，用于研究基因功能并改善植物特征。基因组编辑是通过Cas9核酸内切酶在特定的基因组序列上实现的，以产生由短导RNA（SGRNA）指导的双标准断裂（DSB）。DSB通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）或无错误的同源指导修复（HDR）路径来修复，分别导致基因突变或序列替换。这些细胞DSB修复途径可以被利用以敲除或替换基因。另外，胞质或腺嘌呤碱基编辑器（CBES或ABE）融合到催化死亡的Cas9（DCAS9）或Nickase Cas9（NCAS9）（NCAS9）时，也用于执行精确的基础编辑而无需生成DSB。在本章中，我们描述了通过使用基于CRISPR/CAS9的系统在拟南芥基因组中执行单个/多基因突变和精确基础编辑的详细程序。特别是，描述了转基因线的目标基因选择，SGRNA设计，矢量结构，转化和分析的步骤。该方案有可能适应在其他植物物种（例如水稻）中进行基因组编辑。
通过对引导 RNA 进行位点特异性化学修饰来光控制 CRISPR/Cas9 功能
RNA 引导的 CRISPR/Cas9 系统是一种强大的基因组编辑工具箱，源自原核生物获得性免疫系统 1，过去几年在生物学研究和治疗应用方面受到越来越多的关注。2-5 CRISPR/Cas9 的基因组位点靶向能力依赖于向导 RNA（gRNA）间隔区与基因组 DNA 之间的碱基配对。6 核酸酶失活 Cas9（dCas9）消除了核酸酶活性，但保留了 DNA 靶向能力，已被重新利用，通过采用不同的蛋白质效应 7 例如基因激活和抑制、8,9 基因组位点成像、10,11 核碱基编辑 12,13 和表观遗传修饰，进一步扩展了 CRISPR/Cas9 系统的应用场景。 14,15 与持续活跃的 RNA - Cas9 复合物相比，开发条件控制的 CRISPR 功能尤其令人感兴趣，因为其活性可以以所需的空间和时间方式受到限制，从而实现对基因组的精确操作，同时减少副作用。16 可以通过合理设计 (d)Cas9 或 gRNA 来实现条件控制。(d)Cas9 蛋白的活性可以通过小分子诱导
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
CRISPR/dCas9-Tet1介导的DNA甲基化编辑
DNA甲基化是许多生物过程的关键表观遗传机制，其异常调控与人类多种疾病密切相关。精准操控DNA甲基化有望增进我们对这一关键机制的理解，并开发新的治疗方法。此前，我们只能通过小分子（如5-氮杂-2-脱氧胞苷）或无针对性地干扰相关基因（如DNA甲基转移酶）来改变全基因组的DNA甲基化，这使得研究这种表观遗传标记在特定基因组位点的功能意义变得十分困难。通过将DNA去甲基化过程中的关键酶（Ten-eleven易位双加氧酶1，Tet1）的催化结构域与可重编程的序列特异性DNA靶向分子蛋白dCas9融合，我们开发了一种DNA甲基化编辑工具（dCas9-Tet1），可以有针对性地对特定基因组位点进行去甲基化。 dCas9-Tet1 系统使我们能够仅通过替换单个向导 RNA 来研究几乎任何给定位点的 DNA 甲基化作用。本文，我们描述了一种方案，该方案能够使用 dCas9-Tet1 系统高效、特异性地对各种细胞培养物中特定基因组位点的 DNA 甲基化进行模块化和可扩展的操作。
对细胞外囊泡的释放控制因子进行全面分析
这是技术集合。 DCAS9是CAS9的变体，没有DNA裂解活性，而是与GRNA结合，在这项研究中，我们将其用作GRNA的RNA结合蛋白。 （注3）下一代序列：一个可以同时将数百万到数亿个核酸序列序列序列序列的测序仪，本研究使用它同时分析了GRNA条形码的组成。 （注4）生物信息学：融合领域之一，例如生命科学，信息学和统计学。这项研究通过对通过CIBER筛选获得的大量信息以及有关已知蛋白质到基因网络获得的大量信息探讨了SEV释放重要的生物学过程。联系（请联系演讲者有关研究的详细信息）Kojima Ryosuke，东京大学医学研究生院副教授，电子邮件：kojima [at] M.U-tokyo.ac.ac.ac.ac.jp通用事务团队，东京大学医学院研究生院，电话：03-5841-3304 Email：ISHOMU：ISHOMU [at M.ACACPOK] M.UAC。 Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo Tel: 03-5841-4702 Email: shomu[at]mol.f.u-tokyo.ac.jp Public Relations Division, Japan Science and Technology Agency Tel: 03-5214-8404 Email: jstkoho[at]jst.go.jp Higashide Takanobu, Emerging Research Promotion Department, Japan Science and Technology Agency电话：03-5214-7276电子邮件：souhatsu inquiry [at] jst.go.jp
用于检测细胞内病原体毒力基因的多重 CRISPR 干扰工具
在没有靶标切割的情况下，催化失活的 dCas9 通过在空间上阻止 CRISPR (cr)RNA 指向的给定基因上的 RNA 聚合酶活性来施加转录基因抑制。这种基因沉默技术称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi)，已用于各种细菌物种以检测基因，主要是单独或成对检测。在这里，我们在病原体 Legionella pneumophila 中开发了一个多路复用 CRISPRi 平台，能够同时沉默多达十个基因。通过将强进行性启动子与重复/间隔序列上游的 boxA 元素相结合，克服了 Rho 依赖性转录终止对前体 crRNA 表达的限制。使用针对毒力蛋白编码基因的 crRNA，我们证明 CRISPRi 不仅在无菌培养基中生长期间完全发挥作用，而且在巨噬细胞感染期间也完全发挥作用，并且 CRISPRi 的基因耗竭完全重现了缺失菌株的生长缺陷。重要的是，通过改变重复/间隔序列中 crRNA 编码间隔序列的位置，我们的平台实现了目标的逐渐消耗，这反映在表型的严重性上。因此，多重 CRISPRi 有望用于大量探测大量基因，以破译 L. pneumophila 和其他细菌病原体的毒力策略。
用于慢性疼痛的基因治疗：目标丰富的周围伤害感受器的新兴机会
和受影响细胞的转录组（图2a – d）。例如，RNA干扰（RNAI）通过利用序列特异性抑制基因表达来干扰蛋白质翻译，显示出慢性疼痛治疗的希望，并批准了几种基于RNAI的方法在各种非神经疾病疾病条件下用于临床使用16。慢性疼痛疗法的另一种潜在适用方法使用反义寡核苷酸（ASOS），该方法在转录组水平上起作用以干扰mRNA加工，从而导致感兴趣的蛋白质耗尽并抑制其功能17。但是，RNAi和基于ASO的干扰都在效率以及细胞或组织特异性方面都有局限性。18，19。尽管基因递送方法有了重大改进，但针对特定细胞感兴趣的载体（例如患者的主要感觉神经元）仍然是一个挑战，这阻碍了将实验疗法转化为临床用途。基因编辑中赢得诺贝尔奖的发现为各种治疗性干预措施带来了激动的机会，在单个或小组的核酸的水平上进行了操纵以及调节元素，从而提供了调整细胞活性的前景，包括一组细胞的活性，包括一级SORY NEURONS NEURONS NEURONS 20，20，21 21。例如，CRISPR – CAS9系统允许在DNA水平上进行分子修改，并具有主要的转化前景（图2d）。CRISPR干扰的精度优于RNAi和ASO，部分原因是，与靶向mRNA的干扰方法不同，DCAS9可以在转录水平上进行选择性操纵。正在为改善和扩展CRISPR系统的努力，以提高功效和安全性，包括使用基因组或CRISPR干扰系统中使用催化无效的CAS9 CAS9酶（Dead cas9（DCAS9））在基因组或CRIS PR的干扰系统中进行调整，从而抑制转录的转录，而不会改变DNA序列中的DNA序列，而不会改变基因组序列2222。采用了作用于RNA（ADAR）或催化无效的CAS13的腺苷脱氨酶的RNA靶向的更多方法，还允许对RNA进行编辑，从而以更好的安全性23，24产生瞬时和可逆调节蛋白质表达。像DNA编辑的方法一样，具有表观遗传机制操纵的新兴技术显示出临床使用的巨大转化潜力25。包括CRISPR在内的大多数基因治疗系统都依赖于病毒载体对转基因的妄想（表1），这些媒介具有生物不兼容，基因组压力和不需要的抗tar-效果26、27的风险。鉴于这些挑战，已经探索了替代输送系统，包括使用干细胞，功能化脂质体和免疫学中性纳米载体13，28。自定义病毒capsids，并仔细选择了载体中的基因组插入位点，并操纵了Capsids的自动化机制以及合成递送系统的使用，还可以最大程度地减少当前基因治疗方法的不良反应，并增强在包括Thrance Medical Compores（包括Chrance becompies）中，包括Chrmicapies，包括Chronic 11，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29，29。
使用多顺反子质粒载体验证伊蚊细胞中的 CRISPR 激活系统
伊蚊会将包括黄病毒在内的多种病原体传播给人类，导致高发病率和死亡率。由于适应性和气候变化，这些蚊媒预计将在新的地理区域定居，从而使更多的蚊子面临感染风险。因此，控制伊蚊媒介对于防止疾病传播是必要的。最近，遗传学方法在媒介控制方面显示出良好的前景；然而，操纵蚊子基因组的工具和方法相当有限。虽然 CRISPR-Cas9 系统已被用于伊蚊的基因编辑目的，但基于 dCas9 的基因转录控制仍未得到探索。在本研究中，我们报告了 CRISPR 激活系统在伊蚊细胞中的实施。为此，我们设计、构建和测试了一种基于双质粒的策略，该策略允许表达 dCas9-VPR 和靶向向导 RNA 以及报告基因盒。荧光报告基因水平的定量分析显示了强大的过表达，验证了伊蚊细胞中的 CRISPR 激活。该策略和生物学部分将成为基于合成转录因子的伊蚊基因强劲上调的有用资源，以应用合成生物学方法进行媒介控制。
基于 CRISPR-Cas 系统的微藻 Nanochloropsis oceanica 综合基因组工程工具箱
摘要：微藻可以分别利用大气中的二氧化碳和阳光作为碳源和能量来源，产生工业相关的代谢物。开发用于高通量基因组工程的分子工具可以加速产生具有改良性状的定制菌株。为此，我们开发了一种基于 Cas12a 核糖核蛋白 (RNP) 和同源定向修复 (HDR) 的基因组编辑策略，以产生微藻 Nannochloropsis oceanica 的无疤痕和无标记突变体。我们还开发了一种基于附加质粒的 Cas12a 系统，用于在目标位点有效地引入插入/缺失。此外，我们利用 Cas12a 处理相关 CRISPR 阵列的能力来执行多路复用基因组工程。我们在一次转化中有效地靶向宿主基因组中的三个位点，从而朝着微藻的高通量基因组工程迈出了重要一步。此外，还开发了一种基于 Cas9 和 Cas12a 的 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 工具，用于有效下调目标基因。我们观察到在 N. oceanica 中用 dCas9 执行 CRISPRi 后，转录水平降低了 85%。总体而言，这些发展大大加速了 N. oceanica 的基因组工程工作，并可能为改良其他微藻菌株提供通用工具箱。关键词：Nannochloropsis、微藻、基因组编辑、CRISPR-Cas、基因沉默、核糖核蛋白、Cas9、Cas12a ■ 介绍