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利用杂交作物中的克隆配子来设计多倍体基因组
杂种优势描述的是杂交植株相对于其亲本的产量和稳健性增加，是现代作物育种的基石 1 。除双亲杂种优势外，在玉米、马铃薯和苜蓿中还观察到同源多倍体渐进杂种优势 (APH)，当来自四个不同祖父母的基因组片段组合时，会产生额外的杂种优势效应 2 。APH 尚未在商业育种中得到充分利用，因为减数分裂会重新分配基因型，并且无法生产受益于 APH 的基因一致的种子。先前在拟南芥和水稻中建立的“有丝分裂而非减数分裂”(MiMe) 系统可产生克隆的、未减数的配子 3 – 7 ，但尚未在双子叶作物中建立或在设计多倍体基因组工程中进行测试。在这里，我们建立了番茄多倍体基因组设计，通过两个不同杂交亲本产生的克隆配子的杂交，实现了四种预定义基因组单倍型的可控组合。我们着手在番茄中建立 MiMe 系统，以可控的方式产生克隆配子。基于对番茄减数分裂突变体的基本了解（补充说明 1），我们发现可以通过 SlSPO11-1、SlREC8 和 SlTAM 的突变在自交系番茄中建立功能性 MiMe 系统（图 1a-c、扩展数据图 1 和 2、补充图 1-16 和补充表 1-4）。我们在三种杂交番茄基因型中实施了 MiMe 系统，包括 Moneyberg-TMV ⨯ Micro-Tom (MbTMV-MT) 模型杂交品种、枣番茄商业杂交品种‘Funtelle’和串番茄商业杂交品种‘Maxeza’（图 1a-c）。我们鉴定出两个独立的 MbTMV-MT、三个独立的 Funtelle 和三个独立的 Maxeza 品系，它们在 SlSPO11-1、SlREC8 和
改进高粱转化和基因组编辑，开发稳定品系，用于光合和水分利用效率分析
通过使用基因组编辑和稳定植物转化技术，开发将高粱基因与表型联系起来的基因组水平知识库以实现生物能源目标，对于理解基本生理功能和作物改良至关重要。我们与参与该项目的各个实验室一起贡献中央枢纽能力，以创建、测试和培育转基因和基因组编辑植物。我们已经建立了可靠的协议，用于通过农杆菌介导将实验性遗传构建体引入高粱 cv BTx430，并合作生成该项目正在进行的研究所需的可行转基因。这些实验包括：； (1) 用于敲低的高粱 RNAi 构建体，例如电压门控氯离子通道蛋白、α碳酸酐酶 7 (CA) 和 9-顺式环氧胡萝卜素双加氧酶 4 以及 myb 结构域蛋白 60； (2) 构建体用于测试磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC) 启动子表达、CA 过表达和具有改变动力学的 PEPC 的保真度；(3) 旨在测试一系列增加的叶肉 CA 活性的 CA 过表达的其他版本；(4) Ta Cas 9、dTa Cas9 和 dCas9 转录激活因子用于改进编辑，以及；(5) 构建体用于评估转基因过程的改进，旨在增加转化频率并缩短 T1 种子的时间。这些品系目前处于转基因过程的不同阶段。使用形态发生调节剂介导的转化 (MRMT) 的最新发展是实现快速转化和基因组编辑的突破。我们报告了一种使用 MMRT 技术的改进的快速转化方法的开发，该方法有可能增加我们的项目的吞吐量并缩短时间。与 Voytas 实验室合作，我们评估了 MRMT 载体的公共版本。 Voytas 实验室还在测试递送基因组编辑试剂的新方法，特别是使用 RNA 病毒载体通过感染递送 gRNA。通过感染进行可遗传基因编辑已在多个双子叶植物中实现，我们正在努力在狗尾草和高粱中实施该技术。
植物基因编辑不再需要组织培养
植物基因编辑可对植物进行有针对性的改造，在作物的基因功能分析和精准育种方面显示出巨大的潜力[1]。要生产基因编辑植物，需要将基因编辑试剂[2]（例如 CRISPR/Cas9 成分）递送到植物细胞中。这涉及一个漫长、昂贵且劳动密集型的组织培养步骤，而且目前仅在有限数量的植物物种中可行，这成为植物基因编辑的主要瓶颈。在最近一期的《自然生物技术》上，由 Daniel F. Voytas 领导的明尼苏达大学研究小组描述了一种生产基因编辑植物的新方法，同时避免了组织培养的需要（图 1）[3]。该方法利用了分生组织的从头诱导。分化的植物细胞通常不能分裂或产生不同类型的细胞。然而，之前的研究表明，通过异位表达特定的发育调节因子，可以诱导已经分化的细胞形成分生组织。分生组织是包含未分化干细胞（分生细胞）的植物组织，这些干细胞能够进行细胞分裂，并能产生各种组织和器官。例如，在拟南芥中，WUSCHEL ( WUS ) 基因在胚胎发生中起着关键作用，过表达 WUS 可以促进营养生长向胚胎生长的转变 [ 4 ] 。SHOOT MERISTEMLESS ( STM ) 和 WUS 的联合异位表达可激活拟南芥中的一组分生组织功能，包括细胞分裂和器官发生 [ 5 ] 。 ipt 基因位于土壤细菌农杆菌的 Ti 质粒上，该基因编码异戊烯基转移酶，这种酶在植物中诱导细胞分裂素的生物合成，从而刺激器官发生[6]。在单子叶植物中，婴儿潮基因（Bbm）和 WUS 基因的过度表达可促进体细胞形成胚胎，从而提高转化效率[7]。Voytas 研究小组假设分生组织可以在发育调节因子的帮助下诱导。为了验证这一想法，使用多种启动子以不同的组合在本氏烟植物中表达了玉米 WUS2、拟南芥 STM、农杆菌 ipt 和其他发育调节因子。农杆菌用于传递转基因，并以荧光素酶作为报告基因。形成了分生组织状结构，这些结构长成具有荧光素酶表达的转基因植物，并且发现该特性是可遗传的。然后，使用相同的方法，将针对两个测试基因的单个向导 RNA (sgRNA) 与成功组合的发育调节剂一起引入组成性表达 Cas9 的转基因本氏烟叶中。在产生的芽中，可以验证目标基因的编辑，并且发现突变会传递给下一代。随后出现了一个问题，即在土壤中生长的植物上是否也能诱导分生组织。这种方法确实在许多双子叶植物中被证明是成功的，除了本氏烟草，在马铃薯和葡萄中也是如此。此外，还产生了基因编辑的本氏烟草植物，并且发现一些编辑过的植物不含有用于编辑的转基因。从头分生组织诱导方法被称为 Fast-TrACC（快速处理的农杆菌共培养），与传统的组织培养程序相比具有明显的优势（图 1）。首先，它大大缩短了生产基因编辑植物所需的时间，从几个月缩短到几周。其次，Fast-TrACC 不需要无菌条件，并且适用于在土壤中生长的植物。组织培养方法要求使用无菌工作台和无菌培养基，因此无组织培养方法需要的资源更少，并且适用于较小的群体。第三，当 Cas9 与 sgRNA 一起递送时，在某些情况下会产生基因编辑植物