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Biozym B7高保真DNA聚合酶
5.1。反应缓冲液5x B7反应缓冲液包含：15 mM MGCL 2，5 mm DNTPS，增强剂和稳定器。我们不建议添加进一步的单独的PCR增强剂（例外请参见5.3）或MGCL 2。5.2。引物引物应使用默认引物3设置（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）具有预测的熔点约为60°C。反应中的最终引物浓度应在0.2μm和0.6μm之间。5.3。10倍增强子长模板，富含GC的模板或具有复杂二级结构的模板：如果没有或弱扩增的添加10x B7增强子可以提高产量。5.4。退火使用的退火温度等于下TM引物的TM。如果存在非特异性产品，则以2°C的增量增加。或者使用温度梯度在实验中找到最佳的退火温度。5.5。扩展E Xtension应在72°C下进行。最佳延长时间取决于模板的扩增子长度和复杂性。我们建议大多数模板的延长时间为30秒（KB）。在2步协议的情况下，68至75°C可以用作结合退火/延长温度。5.6。多路复用PCR首次执行多重PCR时，建议在计算出的退火温度周围运行温度梯度。在随后的实验中应使用代表最佳特异性的退火温度。不应使用快速循环条件。最初建议使用最长片段的延长时间。
使用EXO-CIP™快速PCR清理套件处理的PCR扩增子对基因组编辑效率进行快速分析，然后是Sanger测序
对于CRISPR/CAS工作流程，核酸酶和相应GRNA的选择直接影响基因组编辑后的indel频率的计算。当前用于评估编辑效率的当前METH OD使用来自转染的细胞的合并GDNA的PCR扩增，然后是基于测序或基于测序的基于测序或基于不匹配的裂解的分析分析的变性和重新启动的indneal indneal indneal DNA（4）。为加快编辑效率的确定并避免昂贵的NG测序，“通过分解来跟踪Indels”（Tide）（5）和“ CRISPR编辑的推断”（ICE）方法（6）是开发用于使用sanger sequenc dna sequenceenc dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna（ice）方法（ICE）方法（ICE）方法（ICE）。但是，要使这些方法可靠，分析的PCR产品必须具有高质量（例如，单个频带，没有底漆和DNTP）。在本文中，我们证明了通过Exo-CIP快速PCR清洁套件方法清理的扩增子质量匹配，该方法是通过使用ICE软件工具进行批处理分析的传统基于旋转柱的套件来实现的，从而启用了更快，更高的推出方法，以制备旋转后的样品，用于旋转后的样品。
通过Staudinger连接的核苷三磷酸用于DNA的位点特异性标记
最近，设计了采用Staudinger连接进行DNA结合的方法。表明，通过合适的接头系统将叠氮化物功能结合可以使染料与单链DNA的5 9端结合。22 Rajski等。使用Staudinger连接将DNA与随后的Cu（i）诱导的链分裂结合DNA。23在这里，我们报告了一种新型叠氮化物修饰的三磷酸核苷的构建块的开发，该块很容易通过DNA聚合酶将DNA掺入DNA中。可以通过Staudinger连接将所得的双链叠氮化物修饰的DNA与改良的磷酸化。在方案1B中描述了通过使用DNA聚合酶进行随后的Staudinger连接的DNA聚合酶对DNA位点特异性的策略。第一步由DNA聚合酶反应组成，其中一种天然的三磷酸核苷（DNTP）被包含叠氮化物功能的修饰类似物取代。显然，此步骤的成功取决于DNA聚合酶接受改性核苷酸的能力。叠氮化物修饰的双链DNA反过来应用作具有适当功能化磷酸的Staudinger连接的底物。
TAQ DNA聚合酶
建议的存储和稳定性长期存储在-20°C。在标签上陈述了-20°C时的产品到期。选项：在+4°C下存储长达6个月。质量控制TAQ DNA聚合酶的污染活性测试，没有核酸内切酶活性的痕迹，缺口活性或核酸外切酶活性。单位定义一个单位定义为在标准测定条件下，在72°C下，在30分钟内将10 nmol的DNTP纳入酸性dntP的聚合酶量。协议该协议是确保使用TAQ DNA聚合酶时确保最佳PCR的指南。最佳反应条件，例如孵育时间，温度和模板DNA量可能会有所不同，必须单独确定。1。解冻10x缓冲液，DNTP混合和底漆溶液。必须完全解冻溶液（一些缓冲液需要达到室温）并在使用前彻底混合以避免局部盐浓度。将所有组件放在冰上。聚合酶在甘油中提供，不需要解冻。始终将其保持在-20°C。2。与用于DNA制备或产品分析的区域中建立了反应混合物。始终在冰上工作。
区分核苷酸
摘要 细胞内高浓度的核苷酸 ( NTP ) 和低浓度的脱氧核苷酸 ( dNTP ) 之间的不平衡对 DNA 聚合酶从 dNTP 构建 DNA 时提出了挑战。目前认为，DNA 聚合酶通过空间门模型区分 NTP，该模型涉及 B 家族 DNA 聚合酶中聚合酶活性位点的酪氨酸和核苷酸的 2 ′ -羟基之间的冲突。借助活性位点具有 UTP 或 CTP 的 B 家族聚合酶的晶体结构、分子动力学模拟、生化分析和酵母遗传学，我们已经确定了聚合酶的指状结构域感知聚合酶活性位点中 NTP 的机制。与之前提出的极性过滤器相反，我们的实验表明，指状结构域中的氨基酸残基通过空间位阻感知核糖核苷酸。此外，我们的结果表明，掌状结构域中的空间门和指状结构域中的传感器在区分 NTP 时都很重要。结构比较表明，传感器残基在 B 家族聚合酶中是保守的，我们假设在所有类型的 DNA 聚合酶中都应考虑指状结构域中的传感器。
由于双重SAMDH1突变而引起的三名患有AICARDI-GOUTIères综合征的三名患者的诱导多能干细胞系
aicardi-gouti` eRes综合征（AGS）是一种系统性的炎症性疾病，并且在婴儿早期开始时（Aicardi and Goutieres，1984）。患者通常患有白细胞症状，其特征是易怒，肌张力障碍，癫痫发作和发烧，导致严重的发育延迟和小头畸形。脑成像显示基底神经节钙化和进行性脑萎缩。ags模仿子宫内获得的病毒感染。一些患者会出现自身免疫性疾病全身性红斑狼疮患者的体征，包括肝炎，血小板细胞减少症，抗核抗体以及皮肤恐龙病变（Ramantani等，2010）。淋巴细胞增多症和抗病毒细胞因子干扰素（IFN）-α在脑脊液中通常在疾病病程初期观察到。全身激活I型IFN，如外周血细胞中IFN刺激的基因的上调所示（也称为IFN信号）通常可以连续检测到。ags是一种由至少九种不同基因（AGS1-AGS9）突变引起的遗传异质性疾病，该疾病在核酸代谢和免疫识别的过程中起作用（Crow and Stetson，2022）。在这项研究中，使用无整合的仙台病毒方法来重新编程源自皮肤活检或外周血单核细胞（PBMC）的成纤维细胞（来自SAMHD1中的常染色体隐性突变（AGS5）的三名AGS患者（AGS5）（AGS5）（Rice等，2009）。SAMHD1编码SAM结构域和含HD结构域的蛋白1，一种依赖于DGTP的三磷酶氢化酶，将脱氧核苷Tri磷酸盐（DNTPS）转换为组成型脱氧核苷和甲磷酸甲磷酸盐。SAMHD1缺乏会导致内部lular DNTP池失衡，导致基因组不稳定性（Kretschmer等，
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定套件（ARMQ）旨在直接比较平均MTDNA副本NUM
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定试剂盒（ARMQ）旨在直接比较样品的平均mtDNA拷贝数。大鼠mtDNA底漆集识别并放大了大鼠mtDNA上最保守的区域之一，并且不会放大核基因组DNA上的任何脱靶序列。单复制参考（SCR）引物集识别并放大了大鼠染色体17的100 bp长区域，并用作数据归一化的参考。具有已知mtDNA拷贝数的参考基因组DNA样品是计算目标样品的mtDNA拷贝数的参考。精心设计的底漆可确保：（i）值得信赖的量化效率高； （ii）没有非特异性扩增。通过QPCR验证了每个底漆集，并通过熔融曲线分析和凝胶电泳进行了扩增特异性，并通过模板系列稀释来验证。2倍Goldnstart Taqgreen QPCR Master Mix（CAT＃MB6018A-1）是SYBR®基于绿色染料的QPCR主混合物，具有“热启动”属性。它包含单个管中的SYBR®绿色，DNTP，TAQ DNA聚合酶和惰性金色载荷指示器。通过Sciencell独特的化学化学TAQ DNA聚合酶实现的“热启动”特性提供了对引物二聚体形成的最大抑制作用。高级缓冲仪公式提供了较高的特异性和效率，并具有较宽的线性动态范围。惰性金色加载指示器允许在QPCR板或试管中更好地可视化和跟踪样品加载。
T7 DNA聚合酶 Qiagen验证报告 b'' T7 DNA连接酶 Qiagen®多路复用PCR加套件 T4基因32蛋白
大肠杆菌DNA污染单元测试了N/A N/A 100 100 100规格> 99％13,333 U/mg功能性功能性NO conversion <10份蛋白质来源：重组大肠杆菌菌株，携带毒液T7基因5和E. coli trxa基因。单位定义：1个单位定义为将10 nmol的总DNTPS转换为酸不溶性材料所需的聚合酶量，在37°C下30分钟内。分子量：92.1 KDA质量控制分析：使用2倍连续稀释方法测量单位活动。稀释酶，并将其添加到含有小腿胸腺DNA，1x T7 DNA聚合酶单位表征缓冲液（20 mM Tris-HCl，100 mm KCl，6 mM MGCL，6 mM MGCL 2，6mmmmmgcl 2，0.1 mm EDTA，5 mmβ-MMβ-MERCAPTOETOETHANANOL），3 H-DTT的反应中，3 H-DTT，在37°C下孵育10分钟，浸入冰上，并使用Sambrook和Russell的方法进行分析（6）。蛋白浓度（OD 280）由OD 280吸光度确定。物理纯度，然后进行银色染色检测。通过比较浓缩样品中污染物带的聚集质量与稀释样品中蛋白蛋白蛋白带的质量来评估纯度。单链核酸酶在含有放射性标记的单链DNA底物的50 µL反应中确定，在37°C下孵育4小时4小时。双链外切核酸酶在50 µL反应中确定，该反应含有放射性标记的双链DNA底物和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。双链核酸内切酶在50 µL反应中确定，该反应含有0.5 µg质粒DNA和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。大肠杆菌16S rDNA的污染是使用5 µL r菌酸溶液的样品变性的样品，并在Taqman QPCR分析中筛选，以使用与16S rRNA locus相应的寡核苷酸引物，使用污染的大肠杆菌Genomic DNA。