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利用同源性独立的 CRISPR–Cas9 精准基因组编辑快速高效生成敲入人类类器官
类器官可通过诱导多能干细胞和胚胎干细胞的引导分化生成，也可从从成体组织中分离的细胞生成 1 。成体干细胞 (ASC) 衍生的类器官是自组织结构，可重现其来源的不同上皮组织的细胞组成、三维 (3D) 结构和功能的各个方面，同时保持基因组稳定性 2、3 。从转基因小鼠品系（尤其是敲入模型）中获得类器官的可能性使得能够生成工程化小鼠类器官，这些类器官已被用作多功能体外工具来回答各种生物学问题 4 3 10 。生成工程化人类 ASC 衍生类器官需要在建立品系后应用有效的体外基因组编辑策略。CRISPR3Cas9 技术大大简化了基因工程。迄今为止，这些方法主要限于非同源末端连接 (NHEJ) 介导的将插入/缺失引入类器官内源性基因座，从而导致基因突变 11 3 14 。通过利用 HDR 通路，引入单碱基替换来纠正囊性纤维化肠道类器官中的 CFTR 基因座 15 ，并且已经生成了一些人类 ASC 类器官敲入报告系，但主要是在结肠癌类器官中 16 3 18 。使用 HDR 的敲入利用了细胞修复双链断裂 (DSB) 的机制。可以使用 CRISPR3Cas9 在特定位点引入此类断裂。HDR 是用于靶向插入的最常用方法，但该过程效率低下并且要求细胞处于 S 期 19,20 。此外，HDR 需要克隆供体质粒，因为需要存在每个基因特有的同源臂（图 1a）。最近的研究表明，CRISPR 诱导的 DSB 可激活
基本编辑器的精确基因组编辑
摘要：单核苷酸变体约占人类已知的致病遗传变异的一半。基因组编辑策略通过逆转最小侧面效应的致病点突变具有巨大的治疗潜力，现在正在积极追求。基础编辑和主要编辑等精确和有效的基因组编辑策略的出现为核苷酸转化提供了强大的工具，而无需诱导双链DNA断裂（DSB），这表现出了固化遗传疾病的巨大潜力。基本编辑器的多种工具包已被开发，以提高应用程序不同背景下的编辑效率和准确性。在这里，我们总结了基本编辑者的发展（BES），他们的局限性和基于基础编辑的治疗策略的未来观点。
肽融合提高主要编辑效率 1
Prime editing 是一种基于 CRISPR 的“搜索和替换”技术，可在没有双链断裂 (DSB) 或供体 DNA 模板 1 的情况下，在哺乳动物细胞中介导靶向 32 插入、删除和所有可能的碱基对碱基转换。Prime editing 34 酶 (PE2) 由与工程逆转录酶 (RT) 融合的 SpCas9 切口酶组成。35 PE2 通过 Prime editing 向导 RNA (pegRNA) 被招募到目标位点，该 RNA 除了标准基因组靶向间隔区和 SpCas9 结合发夹结构外，还包含 3' 序列，37 该序列充当融合 RT 的模板，以在一条切口 DNA 链上合成编程的 DNA 序列。当细胞 DNA 修复机制修复断裂的链时，这种 RT-39 延伸片段会与未编辑的片段竞争，而编辑后的序列有时会取代基因组中的原始序列 1,2。41
简单促进Cas9和cas12a表达通过多合一策略改善基因靶向
基因靶向（GT）是精确操纵基因组序列的有前途的工具，但是，种子植物中的GT仍然是一项艰巨的任务。通过同源指导修复（HDR）提高GT效率的简单而直接的方法是增加植物目标部位的双链断裂（DSB）的频率。在这里，我们通过结合CAS表达的转录和翻译增强子来报告拟南芥中GT的一种多合一方法。我们发现，通过使用增强剂来促进Cas9和cas12a变体的表达可以改善拟南芥基因组中的DSB和随后的敲门效率。这些结果表明，在特定时机（卵细胞和早期胚胎）下，简单地增加CAS蛋白表达可以改善可遗传的GTS的建立。这种简单的方法允许在植物中进行常规的基因组工程。
使用碱基编辑器进行精确的基因组编辑
摘要：单核苷酸变异约占人类已知致病遗传变异的一半。通过逆转致病点突变且副作用最小的基因组编辑策略具有巨大的治疗潜力，目前正在被积极推行。碱基编辑和主要编辑等精准高效的基因组编辑策略的出现为核苷酸转换提供了强有力的工具，而不会诱导双链 DNA 断裂（DSB），这在治疗遗传疾病方面显示出巨大的潜力。人们开发了各种各样的碱基编辑器工具包，以提高不同应用环境中的编辑效率和准确性。本文，我们总结了碱基编辑器（BE）的发展、它们的局限性以及基于碱基编辑的治疗策略的未来前景。
EPHA5 突变预测...的持久临床益处
TILs：肿瘤浸润淋巴细胞；PFS：无进展生存期；NSCLC：非小细胞肺癌；抗 CTLA-4：抗细胞毒性 T 细胞淋巴细胞-4；PD-L1：程序性死亡配体 1；RTK：Eph 受体酪氨酸激酶；NK：自然杀伤细胞；NGS：靶向下一代测序；DCB：持久临床益处；NDB：无持久益处；OS：总生存期；DFS：无病生存期；GDSC：癌症药物敏感性基因组学；KM：Kaplan-Meier；GO：基因本体论；KEGG：京都基因与基因组百科全书；TCGA：癌症基因组图谱；BER：碱基切除修复；HR：同源重组；MMR：错配修复；FA：范康尼贫血；NER：核苷酸切除修复；NHEJ：非同源末端连接； DSB：DNA 双链断裂；SSB：单链断裂；miRNA：微小RNA；
Rama Devi妇女大学Rama Devi妇女大学
DNA受到许多内源性和外源性损害，会损害DNA复制和适当的染色体分离。DNA双链断裂（DSB）是最危险的病变之一，必须修复以保持染色体完整性。有机体配备了涉及同源重组的几种不同但相关的修复机制，包括单链退火，基因转化和分裂诱导的复制。DNA断裂和修复是细胞功能的核心，其操纵在癌症治疗中起着重要作用。癌细胞通常表现出高的遗传突变率，其中许多因DNA修复机制或DNA损伤而引起的许多。细胞修复DNA断裂的能力对于维持基因组稳定性至关重要，但它也带来了挑战，也是癌症治疗的机会。
DNA双链断裂修复途径的选择与调控
图 1 DSB 修复途径总览 .DSB 发生后 , Ku70-80 会最先结合上来 , 如果不发生末端切除 , 会继而招募 DNA-PKcs, ligase IV, XRCC4 等 cNHEJ 核心因子介导 cHNEJ 修复途径 .如果末端发生 MRN-CtIP 介导的末端切除 , 则会产生 ssDNA 抑制 cNHEJ 修复途 径 .短程切除和长程切除产生的 ssDNA 可以通过链内退火进行修复 , 分别被称为 alt-EJ 和 SSA.长距离切除产生的 ssDNA 也可以 在 BRCA2-PALB2-BRCA1 复合体的帮助下和 RAD51 形成核蛋白纤维 , 进行同源找寻和连入侵过程 , 从而进入 HR 修复途径 .HR 途径又可以分为 BIR, SDSA 和 DSBR Figure 1 Overview of DSB repair pathways.The broken ends are first recognized and bound by Ku70-80.Without end resection, other cNHEJ core factors, such as DNA-PKcs, ligase IV, XRCC4, would be recruited to DSBs to mediate cNHEJ pathway.When MRN-CtIP-mediated resection occurs, the generated ssDNA will inhibit cNHEJ pathway.ssDNA from short-range and long-range resection can anneal in-strand to resolve the damages, termed Alt-EJ and SSA, respectively.ssDNA from long-range resection can also be bound by RAD51 to form nucleoprotein filament under the help of BRCA2-PALB2-BRCA1 complex.Nucleoprotein filament carry out homologous searching and strand invasion, promoting HR pathway.The HR pathway could be divided into BIR, SDSA and DSBR
基于CRISPR/CAS9介导的同源指导修复的有效标记基因切除策略
摘要：为了将转化的细胞与非转化细胞分离，抗生素可选标记基因通常用于遗传转化。获得转基因植物后，通常有必要从植物基因组中去除标记基因，以避免调节问题。但是，许多无标记的系统耗时且劳动力密集。同源性修复（HDR）是使用同源臂进行同源重组的过程，以实现DNA双链断裂（DSB）的精确修复。定期间隔间隔的短质体重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CAS9）系统是一种强大的基因组编辑工具，可以有效地引起DSBS。在这里，我们分离了一个在茎，射击尖端和渗透性中高度表达的基因的水稻启动子（P SSI），并通过使用此P SSI驱动CRISPR/CAS9介导的HDR用于MarkerFree（PSSICHMF），从而确立了高耐高率序列 - 切除策略。在我们的研究中，在73.3％的T 0植物和T 1植物的83.2％中检测到PSSICHMF诱导的标记基因缺失。在T 1后代获得了高比例（55.6％）的纯合标记植物。重组GUS报告者ADAD分析及其对重组产物的测序显示由PSSICHMF方法介导的精确缺失和修复。总而言之，我们的CRISPR/CAS9介导的HDR自动拆卸方法提供了一种节省时间和有效的策略，用于从转基因植物中去除标记基因。
CRISPR-Cas9 基因编辑领域的进展......
与锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALENS；图 1) 相比，成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR 相关 9 (CRISPR-Cas9) 技术设计简单、成本低、效率高、操作简单，已成为近年来应用最广泛的基因编辑技术。CRISPR-Cas9 是一种在细菌中发现的适应性免疫反应，与其他基因编辑技术不同，它可以利用病毒和非病毒平台在多种生物体和细胞类型的双链断裂 (DSB) 中提供熟练的基因组编辑。1 CRISPR-Cas9 技术正在迅速应用于所有生物医学研究领域，包括心血管 (CV) 领域，它促进了人们对心血管疾病 (CVD)、心肌病、电生理学和脂质代谢的更深入了解，并创建了各种细胞和动物模型来评估新疗法。2