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Prime editor 整合酶系统促进靶向 DNA 插入及其他
转录模板和引物结合位点（图 1 A) [1]。无需诱导 DSB 和提供 DNA 供体，prime editing 是一种很有前途的精准基因组编辑技术。Prime edit 最初效率较低 [1]。令人鼓舞的是，通过共表达占主导地位的负错配修复 (MMR) 蛋白来抑制 MMR 去除 prime edit 的异源双链 DNA 产物 [2]，或通过使用具有多核苷酸替换 [3] 或减少 3′ 端降解 [4] 的 pegRNA，取得了改进。Prime edit 通过所有 12 个碱基替换和不同长度的删除，大大提高了基因组编辑能力 [1,5]。然而，一个挑战是使用 PE 插入超过 40 bp 的长 DNA，这部分是由于 pegRNA 3′延伸的长度限制和较长 RNA 的转录效率降低 [1]。为了克服目前 Prime Editing 对长 DNA 插入的限制，最近的两项研究报道了 Prime Editor 整合酶 (PEI) 系统，该系统无缝结合了 Prime Editing 和基于丝氨酸整合酶的重组 [ 6 , 7 ]。
利用 All-in-One 和 HITI CRISPR 技术在中国仓鼠卵巢细胞系中进行多重基因组编辑
简介 在哺乳动物细胞系中产生有利的基因组特征是基因功能研究极为宝贵的策略之一。1,2 基因组编辑主要通过使用传统方法进行，例如 RNA 干扰 3,4 和同源重组。然而，除了染色体 DNA 的自发裂解之外，所需突变体的频率低和特异性低导致了位点特异性核酸酶的发明。最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统为在特定基因组位点快速有效地进行基因编辑打开了一扇有希望的窗口。5,6 CRISPR/Cas9 系统由两个组件组成：向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白的核酸酶活性可在任何被 gRNA 识别的基因组区域中诱导 DNA 双链断裂 (DSB)。该 gRNA 必须伴随目标基因座中相邻的原间隔基序 (PAM) 序列。7,8 NGG 是化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的 PAM 序列，是最
专刊
基因组编辑技术的发展提高了多种遗传性疾病的治疗前景。对于大多数遗传性疾病，高精度 DNA 校正将是可行的。事实上，诸如碱基编辑之类的技术使我们能够校正四种最常见的单碱基替换，而主要编辑可以安装数十个碱基对的任何替换、插入和/或删除。涉及双链 DNA 断裂 (DSB) 的核酸酶依赖性编辑方法通常会导致高比例的不受控制的编辑结果。碱基编辑和主要编辑技术具有更高的效率和更少的副产物，即使在缓慢分裂或不分裂的细胞中也是如此，这些细胞是成年动物中的大多数细胞。因此，这些技术是体内治疗性基因组编辑的有效药剂，不仅在动物模型中，而且在人类中也是如此。因此，我提议出版一期《细胞》特刊，介绍这些技术的惊人进展及其在开发遗传改良植物和真正的个性化医疗治疗中的快速应用。您忠实的，
CRISPR指南RNA设计指南...
1.1通过CRISPR/CAS9通过特定地点的双链断裂（DSB）靶向DNA的基因组编辑（DSB）体现了现代生物技术的基石。随着新工具的发现和开发（例如工程核酸酶），对目标位点的挑战不断降低，随着时间的流逝，挑战[1]。 CRISPR/CAS9系统及其两个组件设置以及简单的目标程序构成可用工具箱中当前的金标准。 在该系统中，CAS9核酸酶的复合物和引导RNA（GRNA）介导了选定的目标位点的DSB诱导。 GRNA具有主要相关性，一方面介导靶DNA接收和结合，另一方面是Cas9的靶DNA裂解[2]。 GRNA的可变区域（指南）确定目标DNA结合的位点，并可以调整为感兴趣的序列。 采用该系统，诸如单一和多重编辑，表观遗传和转录调控，基因组基因局的可视化以及基础编辑的应用在大量生物中是可行的（有关详细信息，请参见评论[3-6]）。 目标选择仅需要挑战[1]。CRISPR/CAS9系统及其两个组件设置以及简单的目标程序构成可用工具箱中当前的金标准。在该系统中，CAS9核酸酶的复合物和引导RNA（GRNA）介导了选定的目标位点的DSB诱导。GRNA具有主要相关性，一方面介导靶DNA接收和结合，另一方面是Cas9的靶DNA裂解[2]。GRNA的可变区域（指南）确定目标DNA结合的位点，并可以调整为感兴趣的序列。采用该系统，诸如单一和多重编辑，表观遗传和转录调控，基因组基因局的可视化以及基础编辑的应用在大量生物中是可行的（有关详细信息，请参见评论[3-6]）。目标选择仅需要
临床应用 先进药物输送
CRISPR/Cas 技术为治疗多种疾病（包括癌症和遗传疾病）提供了一种有希望的方法。尽管 CRISPR/Cas 具有巨大潜力，但将其转化为有效的体内基因治疗仍面临挑战，这主要是因为需要安全高效的递送机制。FDA 批准用于 RNA 递送的脂质纳米颗粒 (LNP) 也显示出递送 CRISPR/Cas 的潜力，能够有效地用单个向导 RNA 包裹大型 mRNA 分子。然而，实现体内精确靶向仍然是一个重大障碍，需要进一步研究优化 LNP 配方。人们正在探索增强特异性的策略，例如修改 LNP 结构和加入靶向配体，以改善器官和细胞类型的靶向性。此外，碱基和主要编辑技术的开发带来了潜在的突破，可提供精确的修改而不会产生双链断裂 (DSB)。主要编辑，尤其是通过靶向 LNP 递送时，有望安全准确地治疗各种疾病。本评论评估了使用
DNA双链断裂修复中的液态液相分离
DNA修复因子通过时空的隔离和DNA双链断裂（DSB）的溶解作用。最近的进步表明，某些DSB修复因子经历了液 - 液相分离（LLP），并显示出类似液滴的特性以及动态材料交换。重要的是，LLP调节了各种生物学过程，异常LLP参与了农业疾病的病理发展。此外，DSB修复过程中DNA修复因子的动态冷凝和溶解的表型呈现了LLP的特性。显着，RNA，聚（ADP-核糖）[PAR]和转录后修饰（PTM），例如磷酸化，泛素化和甲基化，被认为有助于DSB修复因子的LLP。从DSB期间LLP的功能的观点中，DNA修复因子可能会在DSB传感和DNA损伤修复信号转导中作用，参与同源推荐（HR）（HR）和非同源性端始终连接（NHEJ） - 介导的DSB介导的DSB修复，并调节下游径流的途径。基于这些发现，研究人员专注于
血脑屏障的生物学和模型在CRISPR中完善定位
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) is a natural bacterial defense system against bacteriophage infection that has recently been harnessed for genome and tran- scriptome editing in a wide range of organisms based on the generation of double-strand DNA breaks (DSBs) and RNA cleavage (3, 24, 32, 47, 52, 58, 73, 76, 79, 91，127）。是根据工程II（CAS9）和VI型（CAS13）可编程核酸酶，DNA和RNA基础编辑，质量编辑以及CRISPR干扰/激活（CRISPRI/A）编辑（CRISPRI/A）编辑（CRISPRI/A）编辑，启用与基本疾病的校正和安装基本疾病的校正和安装，40个基本疾病的突变（30; 69–71、87、105、115、135），例如转录扰动（138）和表观遗传调节（94）。这些基于DNA的编辑器是通过没有DSB活性的死亡CAS9（DCAS9）或CAS9 Nickase（CAS9N）的融合而生成的，只有对胞嘧啶脱氨酶的活性（例如，APOBEC和C-TO-T编辑的APOBEC和辅助）或trans-FER RNA（TRNA）腺苷（TRNA）腺苷氨基氨基酶（例如，tada）（例如，tada）（37）（37）（37）（37）。RNA编辑系统是通过将DCAS13B/DCAS13D/DCAS13X融合而成的，没有RNA裂解活性与腺苷脱氨酶结构域（例如，ADAR2 DD用于A-TO-I编辑）或工程型胞质Deam-Inase Inase Insaine（例如，ADAR2DD）的87，C-TON 7，c-us-n.7，c.-ty 7，c c. 47，c. 47，c.-ty 7，c-ty 7，c-ty 7，c-us-c.-edy in 13，c-u-u--u-u-udy in 13，c-u-udy in 34，c-u-u--为了启用序列特异性基因组调节，DCAS蛋白还融合到多个基因调节效应子，例如逆转录酶（10），转录阻遏物和激活剂（40，101）和表观遗传性调节器（17，99）。
基因组编辑的当前状态及其含义
基因组编辑涉及使用定位的核酸酶（例如锌指核酸酶，Talens或CRISPR/CAS9）切割DNA双螺旋，并在基因组DNA中的靶向，特定序列引入双链断裂（DSB）。实际上是一对成熟的分子剪刀。然后，使用两种机制之一，通过细胞中的机械修复DSB。一种方法是非同源末端连接（NHEJ），其中两个破裂的末端彼此并排并粘合在一起。此方法容易出错，并且由于维修过程中不可避免的错误，在目标裂解位点会导致目标切割部位的插入和缺失（Indels）。这些误差会改变核酸酶目标位点，并防止进一步的切割事件，并通常禁用或敲除基因功能。另一种修复机制是使用同源核酸修复模板的同源指导修复（HDR）。修复模板可以设计与DSB两侧匹配的同源性区域之间进行所需的修改。这可用于引入一系列基因组编辑，从点突变到全基因插入。
优化的 CRISPR/Cas9 策略用于 CHO 细胞中同源定向多靶向转基因整合
已提出将转基因定点整合到指定基因组位点作为替代 CLD 方法，因为它可以减轻克隆 rCHO 细胞系中出现的高度异质性，从而缩短 CLD 时间 (Lee et al., 2015b; Lee et al., 2019)。可编程核酸酶介导的基因组编辑技术的出现通过诱导定点 DNA 双链断裂 (DSB) 加速了 CHO 基因组的靶向修饰，从而激活 DNA 损伤修复途径。在各种基因组编辑工具中，基于 RNA 引导的工程核酸酶的 CRISPR/Cas9 技术由于其组成简单、靶向效率高，已在 CHO 社区中迅速采用 (Lee et al., 2015a)。值得注意的是，CRISPR/Cas9 已成功应用于以精确的方式将转基因插入目标 CHO 基因组位点，并在创建 DSB 后进行同源定向修复 (HDR) (Lee et al., 2015b; Lee et al., 2016)。
CRISPR-Cpf1 激活内源性 BMP4 基因促进脐带间充质干细胞成骨分化
CRISPR 系统提供了强大的基因组编辑工具，广泛应用于生物和医学研究领域。然而，由于 CRISPR 的脱靶效应而产生的安全问题一直是其应用于再生医学的主要障碍之一。传统的 CRISPR 系统存在通过错误的双链 DNA 断裂 (DSB) 在非目标基因组位点诱发不可预测突变的内在危险。在本研究中，我们展示了一种最近发现的 CRISPR-Cpf1 的安全增强应用，用于靶向基因激活，而不会导致 DNA 双链断裂，从而促进人脐带间充质干细胞 (UC-MSC) 的成骨分化。为此，我们开发了一种与三部分转录激活域 (dAsCpf1-VPR) 融合的催化无活性 AsCpf1，可诱导哺乳动物细胞中靶基因表达的上调。我们观察到 CRISPR-dAsCpf1-VPR 激活剂可通过增加内源性 BMP4 基因的表达水平来增强人类 UC-MSCs 的成骨分化。结果表明 CRISPR-Cpf1 激活剂为骨再生和再生医学提供了多种方法。