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使用 CRISPR/... 的有针对性的、可调节的 DNA 损伤工具
一种使用 CRISPR/Cas9 的靶向和可调节 DNA 损伤工具。Ioannis Emmanouilidis 1、Natalia Fili 2、Alexander W. Cook 2、Yukti Hari-Gupta 1 $、Ália dos Santos 2、Lin Wang 3、Marisa Martin-Fernandez 3、Peter JI Ellis 1* 和 Christopher P. Toseland 2 * 1 肯特大学生物科学学院，坎特伯雷，CT2 7NJ，英国。2 谢菲尔德大学肿瘤和代谢系，谢菲尔德，S10 2RX，英国。3 中央激光设施，哈威尔研究中心，科学和技术设施委员会，卢瑟福阿普尔顿实验室，哈威尔，迪德科特，牛津，OX11 0QX，英国。$ 当前位置：MRC LMCB，伦敦大学学院，伦敦，WC1E 6BT，英国。 * 通讯地址：pjiellis@kent.ac.uk 和 c.toseland@sheffield.ac.uk 关键词：DNA 损伤、Cas9、双链断裂、DNA 修复 摘要 哺乳动物细胞不断遭受各种 DNA 损伤事件，从而导致 DNA 修复途径的激活。了解 DNA 损伤反应的分子机制有助于开发针对这些途径元素的治疗方法。双链断裂 (DSB) 对细胞活力和基因组稳定性特别有害。通常，DSB 修复是使用 DNA 损伤剂（例如电离辐射或基因毒性药物）来研究的。这些会在非预测性基因组位点诱发随机损伤，而这些位点的损伤剂量难以控制。此类干预措施不适合研究不同 DNA 损伤识别和修复途径如何根据局部染色质状态在特定 DSB 位点被调用。 RNA 引导的 Cas9 (CRISPR 相关蛋白 9) 核酸内切酶是介导靶向基因组改变的有力工具。基于 Cas9 的基因组干预是通过在感兴趣的基因组区域形成 DSB 实现的。在这里，我们利用基于计算机预测的定制设计的混杂引导 RNA，在整个人类基因组中诱导特定数量和位置的 DSB 的能力。这是通过重组 Cas9-引导复合物的电穿孔实现的，该复合物提供了一种在细胞培养模型中诱导受控 DNA 损伤的通用、低成本和快速方法。引言生物体最关键的过程之一是使用 DNA 损伤监视和修复机制来维持基因组完整性。这些机制可阻止细胞通过细胞分裂进展，从而将有缺陷的基因组传播给子细胞 1。如果病变得不到修复，突变就会积累，导致细胞衰老和癌症等疾病的发作。在人类细胞中每个细胞周期大约会发生 10-50 次双链断裂 (DSB) 2,3 。
多能干细胞基因编辑的进展与展望
摘要：可编程核酸酶在基因编辑中的应用极大地改变了当前基础生物学和临床转化的研究。人类多能干细胞 (PSC)（包括胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPSC)）中的基因编辑与临床细胞治疗高度相关，因此应特别谨慎地进行研究。首先，由于 PSC 中的所有突变都会传递给其所有后代，因此编辑器的脱靶编辑将被放大。其次，由于 PSC 对 DNA 损伤的高度敏感性，基因编辑造成的双链断裂 (DSB) 可能导致编辑效率低下和基因组保护缺陷的细胞群富集。在这方面，DSB 独立的基因编辑工具（如碱基编辑器和主要编辑器）因其避免这些后果的性质而受到青睐。随着对微生物世界的了解越来越多，Cas 相关核酸酶、转座子和重组酶等新系统也正在扩大基因编辑工具箱。在这篇综述中，我们讨论了可编程核酸酶在 PSC 中用于基因编辑的当前应用、研究人员为优化这些系统所做的努力，以及可能用于分化建模和治疗应用的新工具。
胰腺癌同源重组修复缺陷的检测和治疗意义：叙述性综述
PDAC 肿瘤的基因组测序研究表明，高达 15% (4) 的肿瘤存在缺陷，由于 DNA 修复缺陷而导致基因组不稳定 (5)。DNA 修复途径对于保护细胞免受外源性和内源性 DNA 损伤至关重要。这些途径在癌细胞中经常出现功能障碍，导致 DNA 损伤积累和基因组不稳定 (6)。同源重组缺陷 (HRD) 是一种复杂而动态的肿瘤表型，其特征是无法通过同源重组修复 DNA 中的双链断裂 (DSB)。另一个高度保守的 DNA 修复过程是涉及单链 DNA 断裂的碱基切除修复途径。聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 酶是该途径的关键元素。约 5–8% 的 PDAC 与 BRCA1/2 致病性种系变异有关，导致 BRCA 功能缺陷，因此更依赖 PARP 进行 DNA 修复；如果这些患者对含铂化疗的一线治疗有反应，他们可以从 PARP 抑制剂的维持治疗中受益 (7)。在此，我们根据叙述性综述报告清单（可访问 https://jgo.amegroups.com/article/view/10.21037/jgo-23-85/rc）对 PDAC 中的 HRD 进行了综述。
CRISPR/CAS9的基因组编辑工具箱，用于拟南芥
CRISPR/CAS9系统已成为一种强大的基因组工程工具，用于研究基因功能并改善植物特征。基因组编辑是通过Cas9核酸内切酶在特定的基因组序列上实现的，以产生由短导RNA（SGRNA）指导的双标准断裂（DSB）。DSB通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）或无错误的同源指导修复（HDR）路径来修复，分别导致基因突变或序列替换。这些细胞DSB修复途径可以被利用以敲除或替换基因。另外，胞质或腺嘌呤碱基编辑器（CBES或ABE）融合到催化死亡的Cas9（DCAS9）或Nickase Cas9（NCAS9）（NCAS9）时，也用于执行精确的基础编辑而无需生成DSB。在本章中，我们描述了通过使用基于CRISPR/CAS9的系统在拟南芥基因组中执行单个/多基因突变和精确基础编辑的详细程序。特别是，描述了转基因线的目标基因选择，SGRNA设计，矢量结构，转化和分析的步骤。该方案有可能适应在其他植物物种（例如水稻）中进行基因组编辑。
引用方式：Rovani BT、Rissi VB、Rovani MT、Gasperin BG、Baumhardt T、Bordignon V、Bauermann LF、Missio D、Gonçalves PBD。核成熟分析
放射治疗会破坏肿瘤细胞，但也会威胁到周围正常细胞的完整性和存活率。因此，接受放射治疗的妇女可能会出现永久性卵巢损伤，导致生育能力受损。本研究的目的是调查用于治疗人类卵巢癌的治疗剂量电离辐射 (IR) 对作为实验模型的牛卵丘-卵母细胞复合体 (COC) 的影响。牛卵巢分别暴露于 0.9 Gy、1.8 Gy、3.6 Gy 或 18.6 Gy IR，然后收集 COC 并用于评估：(a) 卵母细胞核成熟；(b) 磷酸化 H2A.X (γH2AX) 的存在，作为 DNA 双链断裂 (DSB) 的指标；以及 (c) 参与 DNA 修复 ( TP53BP1、RAD52、ATM、XRCC6 和 XRCC5 ) 和细胞凋亡 ( BAX ) 的基因表达。本研究中测试的辐射剂量对核成熟没有不利影响，也没有增加卵母细胞中的 γH2AX。然而，IR 处理改变了 RAD52 (RAD52 同源物，DNA 修复蛋白) 和 BAX (BCL2 相关 X 蛋白) 的 mRNA 丰度。我们得出结论，虽然 IR 剂量对卵母细胞核成熟和 DNA 损伤没有明显影响，但参与 DNA 修复和细胞凋亡的分子通路受到卵丘细胞中 IR 暴露的影响。
ASP 2024抽象书
成功的CRISPR/CAS介导的基因组编辑取决于在特定的DNA序列下的双链断裂（DSB）的诱导以及随后的错误修复机制的启动。但是，影响CRISPR/CASPR介导的DSB效率和维修保真度的因素在植物中仍未探索。这项研究使用Nicotiana Benthamiana探索DSB修复机制对CAS9和CAS12A酶的编辑效率的影响。测试了基因间（BUR2启动子）和外显子（RDR1）区域中的多个目标位点，以测试在体外和体内编辑中裂解的敏感性。目标部位之间的体内编辑和体外切割效率差异很大。此外，体内编辑效率没有反映体外切割效率。这些结果表明，通过DNA修复机制进行完美的重新连接会损害明显的编辑效率，这表明Indel积累可能无法准确反映CRISPR/CASPR/CAS介导的基因组编辑效率。可以成功设计在DSB修复期间量化和减少完美重新连接的工厂系统。对该系统进行的正在进行的测试表明，不同的CAS酶在DSB修复过程中具有不同级别的完美重新搭配，提供了见解，以进一步优化植物中的编辑策略。
必需REC114 – MEI4三聚体界面的结构和DNA桥接活性
启动减数分裂重组的DNA双链断裂（DSB）由包括Rec114和Mei4（RM）在内的进化套件形成，这些因素在空间和时间上调节了DSB形成。在体内，这些蛋白质形成了与高阶铬合成某些结构的大型免疫染色灶。在体外，它们形成了一个2：1的异三聚体配合物，该复合物与DNA结合以形成大型动态冷凝物。然而，缺乏对RM复合物的原子结构和动态DNA结合特性的理解。在这里，我们报告了由MEI4的N末端的Rec114的c末端的异三聚体复合物的结构模型，并由核磁共振实验支持。这种最小的复合物缺乏预测的Rec114内固有无序区域，足以结合DNA并形成浓度。单分子实验表明，最小的复合物可以桥接两个或多个DNA双链体，并可以通过远距离相互作用产生力来凝结DNA。alphafold2预测了不同分类单元的RM直系同源物的相似结构模型，尽管它们的序列相似程度较低。这些发现提供了对蛋白质和蛋白质 - 蛋白质 - DNA相互作用的保守网络的洞察力，这些网络可以形成冷凝水并促进减数分裂DSB的形成。
植物基因组编辑面临的巨大挑战
世界依赖农业，而农业本身也面临着巨大的挑战，例如满足不断增长的人口对食物、纤维和生物能源的需求。必须利用不断减少的可耕地面积来满足这些需求，同时还要适应导致洪水、干旱和高温更频繁的气候变化，以及培育能够抵抗疾病和害虫且几乎不使用有害环境的化学物质的农作物。所有这些挑战都需要创新的解决方案，这些解决方案将源自植物科学和农业领域的基础和应用研究，包括基因组编辑。基因组编辑是指实现精确的基因组修改，例如在细胞或生物体中对 DNA 进行位点特异性插入、删除、替换和表位等位基因改变。基因组编辑基本上是基于体内 DNA 双链断裂 (DSB)，这种断裂是由经过编程以识别预选基因组位点的工程内切酶诱导的，并利用细胞 DSB 修复机制 (Carroll, 2014)。可编程核酸酶包括巨核酸酶（ Gong 和 Golic，2003 年）、锌指核酸酶 (ZFN)（Urnov 等人，2005 年）、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)（Christian 等人，2010 年；Li 等人，2011 年）和成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 相关核酸酶 (Cas)（Jinek 等人，2012 年；Cong 等人，2013 年；Mali 等人，2013 年）。此外，工程化核酸酶变体可以在没有 DSB 的情况下进行基因组编辑（例如，通过引起 DNA 单链断裂）（Rees and Liu，2018 年）或表观基因组编辑（完全没有 DNA 断裂，也没有 DSB 修复）（Holtzman and Gersbach，2018 年）。基因组编辑已成为最重要的生物技术工具，它促进了我们的生物学知识和生物技术领域本身的增长，并做出了巨大贡献，推动了工业、医学和农业的快速发展。在过去的 10 年中，我们目睹了基于 CRISPR 的基因组编辑技术的快速发展及其在植物功能基因组学和作物改良等各个领域的应用。植物中的基因组编辑技术包括序列特异性核酸酶的工程设计、编辑试剂的递送、编辑事件的产生和选择以及完整植物的表征和利用，这对公众接受基因组编辑植物和监管部门的批准具有进一步的影响。在过去的十年中，基因组编辑平台已经建立并应用于 45 多个植物属（Shan et al.，2020）。然而，为了更好地理解基因组编辑的分子和遗传机制、持续改进和植物中基因组编辑技术的新应用，仍然需要进行大量的研究工作。具体而言，植物基因组编辑面临如下主要挑战。
基因组编辑方法的比较评论
摘要：基因组编辑是一种利用工程化核酸酶对许多生物体基因组进行精确修改的新兴技术。所有基因组编辑工具都依赖于在目标位点处创建双链断裂 (DSB)，然后通过同源定向修复 (HDR) 或非同源末端连接 (NHEJ) 途径进行修复，从而产生所需的遗传修饰。主要的基因组编辑工具包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR/Cas9 系统。通过创建精确的基因型修饰，这些工具可以在各种科学领域（尤其是医学、生物研究和生物技术）中创建不同的表型。自 2010 年以来，随着 TALEN 的出现，模式生物的基因组修饰已成为可能。随后，2013 年，CRISP/Cas9 系统开启了基因组编辑研究的新时代，这可谓是生物学的一场革命。此外，在不久的将来，基因组编辑将能够治疗遗传疾病。此外，基因组编辑在生产具有有用特性的不同作物和牲畜方面的前景也十分光明。这些产品被称为非转基因生物 (GMO) 的编辑作物。在这篇综述中，将介绍并简要比较主要的基因组编辑工具。
使用 CRISPR 的有针对性的、可调节的 DNA 损伤工具......
摘要：哺乳动物细胞不断受到各种 DNA 损伤事件的影响，从而导致 DNA 修复途径的激活。了解 DNA 损伤反应的分子机制有助于开发针对这些途径元素的治疗方法。双链断裂 (DSB) 对细胞活力和基因组稳定性特别有害。通常，使用 DNA 损伤剂（例如电离辐射或基因毒性药物）研究 DSB 修复。这些会在难以控制损伤剂量的非预测基因组位点处引起随机损伤。此类干预不适合研究特定 DSB 位点如何根据局部染色质状态调用不同的 DNA 损伤识别和修复途径。RNA 引导的 Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）核酸内切酶是介导靶向基因组改变的强大工具。基于 Cas9 的基因组干预是通过在感兴趣的基因组区域形成 DSB 来实现的。在这里，我们利用基于计算机预测的定制设计的混杂向导 RNA，在人类基因组的特定数量和位置诱导 DSB。这是通过重组 Cas9-向导复合物的电穿孔实现的，它提供了一种通用、低成本且快速的方法，用于在细胞培养模型中诱导受控 DNA 损伤。