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UHRF1依赖性PAF15泛素信号的终止由USP7和ATAD5
摘要UHRF1依赖性的泛素信号在维持DNA甲基化的调节中起着不可或缺的作用。uhrf1催化PAF15（PAF15UB2）的瞬时双单偶联化，该单次单位化在DNA复制过程中调节DNMT1在DNA甲基化位点的定位和激活。尽管UHRF1介导的PAF15泛素信号传导的启动已经相对良好，但其终止终止的机制以及如何在维持DNA甲基化完成后尚未阐明它们的终止。这项研究表明，USP7的去泛素化和ATAD5（酵母中的ELG1）卸载是从染色质中去除PAF15的关键过程。在复制染色质时，USP7在与DNMT1的复合物中专门与PAF15UB2相互作用。USP7耗竭或抑制USP7和PAF15之间的相互作用会导致染色质上PAF15UB2异常积累。此外，我们还发现，PAF15（PAF15UB0）的非泛素化形式以ATAD5依赖性方式从染色质中删除。PAF15UB2在染色质上保持高水平，这表明维持DNA甲基化的完成对于终止UHRF1介导的泛素信号是必不可少的。这一发现提供了在S相结束时如何拆卸维持DNA甲基化机制的分子底蕴。
基于活动的 CRISPR 扫描揭示 DNA 甲基化维护机制中的变构效应 Kevin C. Ngan 1,2 , Samuel M. Hoenig 1 , Pallavi M. Gosavi
基于活动的 CRISPR 扫描揭示 DNA 甲基化维持机制中的变构 Kevin C. Ngan 1,2、Samuel M. Hoenig 1、Pallavi M. Gosavi 1,2、David A. Tanner 1、Nicholas Z. Lue 1,2、Emma M. Garcia 1,2、Ceejay Lee 1,2 和 Brian B. Liau 1,2 * 隶属关系：1 美国马萨诸塞州剑桥市化学与化学生物学系 2 美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学和麻省理工学院 Broad 研究所 02142 *通讯地址：liau@chemistry.harvard.edu 摘要 变构能够动态控制蛋白质功能。一个典型的例子是严格协调的 DNA 甲基化维持过程。尽管变构位点具有重要意义，但系统地识别变构位点仍然极具挑战性。在这里，我们使用基于活性的抑制剂地西他滨对必需的维持甲基化机制——DNMT1 及其伴侣 UHRF1——进行 CRISPR 扫描，以揭示调节 DNMT1 的变构机制。通过计算分析，我们确定了远离活性位点的 DNMT1 中假定的突变热点，这些热点包括跨越多域自抑制界面和未表征的 BAH2 域的突变。我们从生化角度将这些突变表征为增加 DNMT1 活性的功能获得突变。将我们的分析推断到 UHRF1，我们在多个域中辨别出假定的功能获得突变，包括跨自抑制 TTD-PBR 界面的关键残基。总的来说，我们的研究结果强调了基于活性的 CRISPR 扫描在提名候选变构位点方面的实用性，甚至超越了直接药物靶点。简介变构是一种基本特性，它使蛋白质能够将一个位点的刺激作用转化为调节另一个远端位点的功能。尽管进行了深入研究，但在不同的蛋白质靶标中识别变构位点仍然具有挑战性，并且高度依赖于上下文。与正构位点不同，变构位点在相关蛋白质之间的保守性通常较低，并且控制其结构特征和特性的原理尚不清楚。1,2 由于这些挑战，用于识别和表征变构位点的实验和计算方法较少。3 尽管如此，人们仍在努力开发小分子变构调节剂，因为与正构配体相比，变构位点的结构多样性具有更高的选择性、更低的毒性和蛋白质功能的微调潜力。1,2 因此，开发能够识别变构机制的新工具将进一步加深我们对蛋白质调控的理解并促进药物发现。同时利用药理学和遗传学扰动已广泛成功地用于靶标反卷积和阐明药物作用机制。4 特别是，识别出导致药物耐药性的突变可为靶向作用提供关键验证，并且通常可以阐明潜在的生物学原理。5 尽管许多耐药性突变发生在药物结合位点附近，但它们也可能出现在靶蛋白的远端位置。即使药物在正构位点内结合，这些远端突变也可以通过扰乱变构机制起作用。6–8 例如，对 ABL1 抑制剂（包括正构和变构抑制剂）的耐药性突变始终出现在药物结合位点之外，并通过破坏非活性构象或以其他方式中和 ABL1 自身抑制来驱动耐药性。8–12 此类
工程化蛋氨酸腺苷转移酶级联用于活细胞中单个 DNA 甲基化的代谢标记
摘要：甲基化是一种广泛存在的天然修饰，具有多种调节和结构功能，由大量 S -腺苷-L -蛋氨酸 (AdoMet) 依赖性甲基转移酶 (MTases) 进行。AdoMet 辅因子由多聚体蛋氨酸腺苷转移酶 (MAT) 家族从 L -蛋氨酸 (Met) 和 ATP 产生。为了推进机制和功能研究，已经开发出重新利用 MAT 和 MTase 反应以接受来自相应前体的可转移基团的扩展版本的策略。在这里，我们使用结构引导的小鼠 MAT2A 工程，以便从合成的蛋氨酸类似物 S -(6-叠氮己-2-炔基)-L -同型半胱氨酸 (N 3 -Met) 生物催化生产扩展的 AdoMet 类似物 Ado-6-叠氮化物。三种工程化的 MAT2A 变体表现出对延伸类似物的催化能力，并且在没有和存在竞争性 Met 的情况下，都支持与 M. Taq I 和小鼠 DNMT1 的工程化变体在级联反应中进行 DNA 衍生化。然后，我们使用 CRISPR-Cas 基因组编辑将两种工程化变体作为 MAT2A-DNMT1 级联安装在小鼠胚胎干细胞中。所得细胞系在暴露于 N 3 -Met 且存在生理水平的 Met 时，保持正常的活力和 DNA 甲基化水平，并显示出 Dnmt1 依赖的 DNA 修饰和延伸叠氮化物标签。这首次展示了一种用于生物合成生产延伸 AdoMet 类似物的遗传稳定系统，该系统能够在活哺乳动物细胞中对 DNMT 特异性甲基化组进行轻度代谢标记。■ 简介
全局DNA甲基化和多发性骨髓瘤患者的DNMT3A表达增加
目标。本研究的目的是比较多发性骨髓瘤（MM）不同阶段的患者中选定的DNA甲基转移酶和全球DNA甲基化状态的表达谱。进行分析，使用了不同的细胞群，包括未分离的骨髓瘤细胞和一组用相关抗体纯化的浆细胞。因此，将实验室数据与患者的临床数据进行了比较。患者和方法。进行分析，使用了44例44例患者（30例新诊断，9例复发和5例缓解患者）的未排序骨髓细胞群，并使用了8例患者的样本样本。我们使用了从3个健康个体的BM中分离出的COM可用RNA作为对照样品。通过定量RT-PCR进行了三种DNA甲基转移酶 - DNMT1，DNMT3A和DNMT3B的表达分析，并通过比色测定法检测到患者全局DNA甲基化谱。结果。未改变的DNMT1表达。归一化的DNMT3A基因表达在全球范围内更高。低（0.08–1.81％）的全球DNA甲基化状态在多发性骨髓瘤患者的无分类样品中与受监测的DNA甲基转移酶的SION谱或基于Durie-Salmon和International分期系统的MM阶段相关。结论。这是多发性骨髓瘤患者的不同阶段中DNA甲基转移酶表达谱和全局DNA甲基化状态之间的首次比较研究。注册了多发性骨髓瘤患者的未分布细胞群之间的全球甲基化水平与临床阶段之间没有显着相关性。DNMT3A基因的过表达发生在多发性骨髓瘤的患者的分类细胞和未分布的细胞群中。这一事实强调了DNMT3A是多发性骨髓瘤肿瘤前体的潜在标记。此外，我们在分类细胞群体和未分类的细胞群体中表达了DNA甲基转移酶表达的可比结果。这是从有条理的角度来看的一个有希望的结果，因为与未分类的多个骨髓瘤细胞样品相比，分类细胞的样品会减少所执行的可能分析的数量。
胰腺 α 细胞转分化的最新进展...
随着全球糖尿病患病率的上升，胰岛素治疗和口服降糖药等传统治疗方法往往无法达到最佳血糖控制，从而导致严重的并发症。最近的研究集中于通过 a 细胞的转分化来补充胰腺 b 细胞，这提供了一种有希望的治疗途径。本综述探讨了 a 细胞到 b 细胞转分化的分子机制，强调了关键转录因子，例如 Dnmt1、Arx、Pdx1、MafA 和 Nkx6.1，并讨论了潜在的临床应用，特别是在以严重 b 细胞功能障碍为特征的 1 型和 2 型糖尿病中。其中还包括转分化效率低、细胞稳定性和安全性问题等挑战。未来的研究方向包括优化分子途径、提高转分化效率和确保 b 细胞身份的长期稳定性。总体而言，将 a 细胞转化为 b 细胞的能力代表了糖尿病治疗的一种变革性策略，为严重 b 细胞丢失的患者提供了更有效和可持续的治疗希望。
斑马鱼表观基因组
根据Howe等人在自然界发表的论文。（2013），70％的蛋白质编码人基因与斑马鱼（Danio Rerio，ZF）中发现的基因有关，已知与人类疾病相关的基因中有84％具有ZF对应物。为了瞥见BPA对人荒地的潜在影响，我们确定了在步骤1中发现的ZF基因的人类同源物，并使用人类数据库（例如Ipathwaywayguide and ToppFun）对其进行了分析。我们的数据表明，3周暴露于BPA的成人ZF中的几个miRNA，包括一些在人类中也表达的miRNA，保证在人类中进行进一步的直接调查。我们的研究还表明，BPA影响ZF生殖系统标记物以及与非酒精性脂肪肝病（NAFLD），细胞周期，自噬/凋亡，氧化磷酸化和癌症有关的途径。我们还确定了几种表观遗传因子被BPA上调，包括EZH2，EZH2是一种连接2种基因沉默的表观遗传系统的组蛋白甲基转移酶，特异性组蛋白甲基化和DNA甲基化（Doherty等人。 2010）。 EZH2的过表达已在许多人类癌症中描述。 我们的“表观遗传学”热图（图6）表明，BPA增加了EZH2的表达，以及DNMT1（DNA甲基转移酶）。 这与Doherty等人一致。 2010和Santangeli等。 （2016）。 这些数据共同表明，在成人ZF中，对BPA的“短期”接触可以改变包括miRNOME在内的表观基因组。 2013）。2010）。EZH2的过表达已在许多人类癌症中描述。 我们的“表观遗传学”热图（图6）表明，BPA增加了EZH2的表达，以及DNMT1（DNA甲基转移酶）。 这与Doherty等人一致。 2010和Santangeli等。 （2016）。 这些数据共同表明，在成人ZF中，对BPA的“短期”接触可以改变包括miRNOME在内的表观基因组。 2013）。EZH2的过表达已在许多人类癌症中描述。我们的“表观遗传学”热图（图6）表明，BPA增加了EZH2的表达，以及DNMT1（DNA甲基转移酶）。这与Doherty等人一致。2010和Santangeli等。（2016）。这些数据共同表明，在成人ZF中，对BPA的“短期”接触可以改变包括miRNOME在内的表观基因组。2013）。斑马鱼是一个伟大的毒理学系统模型，具有许多优势，例如高繁殖力，短代循环，低成本维持，基因组易于修饰，胚胎和成人的透明度，胚胎在外部，高，高的，高的遗传代码在早期的生活阶段和活跃的阶段和跨越阶段的发展阶段。使用斑马鱼作为癌症模型的想法出现了10年前，现在开始产生结果（White等人与使用人类和小鼠系统的癌症生物学社区一致，斑马鱼模型可以提供一套独特的工具，可以帮助癌症研究工作。对于其他研究领域，包括NAFLD，这是一种高度普遍的严重慢性肝病，影响了所有美国人的1/3 rd。基于基因鹅肝（鹅卵石）的突变而存在的斑马鱼模型，该突变导致类似于人NAFLD的脂肪肝病，其特征是幼虫的幼虫中富含脂质的肝细胞和幼虫的细胞凋亡，年轻时为5 dpf（Goldsmith＆Jobin，2012年）。鉴于包括miRNA在内的表观遗传特征的变化已被证明可以驱动动物和人类模型中许多疾病的进展，因此清楚地确定BPA如何影响表观遗传组和下游途径的表观概念组很重要。据我们所知，这是第一个研究BPA对斑马鱼mirnome的影响的研究。据我们所知，这是第一个研究BPA对斑马鱼mirnome的影响的研究。
与血红蛋白病相关的 C2H2 锌指转录因子
在人类中，β-珠蛋白的特异性畸变会导致镰状细胞病和β-地中海贫血，而这些疾病的症状可以通过增加胎儿珠蛋白 (HbF) 的表达来改善。最近进行的两次 CRISPR-Cas9 筛选以 ~1500 种带注释的序列特异性 DNA 结合蛋白为中心，在表达成人血红蛋白的人类红系细胞中进行，发现了四组 HbF 基因表达的候选调节因子。它们是 (1) 已知可用于控制 HbF 的核小体重塑和去乙酰化酶 (NuRD) 复合蛋白的成员；(2) 七种 C2H2 锌指 (ZF) 蛋白，其中一些 (ZBTB7A 和 BCL11A) 已知可直接沉默成人人类红系细胞中的胎儿 γ-珠蛋白基因；(3) 一些其他不同结构类别的转录因子，它们可能间接影响 HbF 基因表达； （4）DNA 甲基转移酶 1 (DNMT1) 维持 DNA 甲基化标记，这些标记将 MBD2 相关的 NuRD 复合物吸引到 DNA 上，以及相关的组蛋白 H3 赖氨酸 9 甲基化。本文我们简要讨论了这些调节剂（特别是 C2H2 ZF）在诱导 HbF 表达以治疗 β 血红蛋白疾病方面的作用，以及开发安全有效的小分子疗法以调节这种高度保守的血红蛋白转换的最新进展。
FAAH-OUT 相关人类疼痛的分子基础......
慢性疼痛影响着全球数百万人，迫切需要新的治疗方法。确定新型镇痛策略的一种方法是了解导致人类遗传性疼痛不敏感障碍的生物功能障碍。在本文中，我们报告了最近发现的大脑和背根神经节表达的 FAAH-OUT 长链非编码 RNA (lncRNA) 基因如何调节相邻的关键内源性大麻素系统基因 FAAH，该基因编码可降解花生四烯酸酰胺的脂肪酸酰胺水解酶。我们证明 FAAH-OUT lncRNA 转录的中断会导致 FAAH 启动子内发生 DNMT1 依赖的 DNA 甲基化。此外，FAAH-OUT 包含一个保守的调控元件 FAAH-AMP，可作为 FAAH 表达的增强子。此外，通过对患者来源的细胞进行转录组分析，我们发现了因 FAAH-FAAH-OUT 轴破坏而失调的基因网络，从而为理解观察到的人类表型提供了连贯的机制基础。鉴于 FAAH 是治疗疼痛、焦虑、抑郁和其他神经系统疾病的潜在靶点，对 FAAH-OUT 基因调节作用的新认识为未来基因和小分子疗法的开发提供了平台。
人类甲基化和非甲基化DNA集
产品描述人类甲基化和非甲基化的DNA集由两个对照DNA（非甲基化和甲基化）以及一组特定设计的引物，可与EZ DNA甲基化 - 甲基化 - 光点™结合使用，EZ DNA甲基化 - ez DNA甲基化基因甲基化基因甲基化基因，EZ DNA甲基化基因， Zymo研究以评估DNA的亚硫酸含量转化的效率。从包含DNA甲基转移酶DNMT1（ - / - ）和DNMT3B（ - / - ）1的细胞中纯化了人类HCT116 DKO非甲基化DNA。源自HCT116 DKO细胞的DNA具有低水平的DNA甲基化，可用作DNA甲基化分析的对照（图1）。人类HCT116 DKO甲基化的DNA被纯化为HCT116 DKO DNA，并且已在所有胞质位置进行了酶甲基化，该位置包括M.SSSI甲基转移酶2的CG二核苷酸，并可以用作DNA甲基化分析的阳性对照。在亚硫酸盐处理后，甲基化的胞嘧啶仍未转化（在哺乳动物中，胞嘧啶甲基化主要发生在CPG的情况下），而PCR后，非甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶并被检测为胸骨。DAPK1控制引物扩增了与死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）基因的甲基化，非甲基化和混合甲基化拷贝，并用于在甲硫酸盐转化对照DNA后用于使用。恢复的DNA非常适合许多应用，包括下游分析，例如PCR，限制性核酸内切酶消化，测序等。
习惯性每日摄入油炸食品会通过 NOTCH1 触发的细胞凋亡增加心力衰竭的跨代遗传风险
油炸食品在西方饮食模式中非常普遍。西方饮食与患心血管疾病的高风险存在不利联系。心力衰竭 (HF) 是一种心血管疾病亚型，是一种发病率和死亡率都很高的全球流行病。然而，长期食用油炸食品与 HF 发病之间的因果关系仍不清楚。我们的基于人群的研究表明，经常食用油炸食品与 HF 风险增加 15% 密切相关。因果关系可能归因于油炸食品中的丙烯酰胺饮食暴露。进一步的横断面研究表明，丙烯酰胺暴露与 HF 风险增加有关。此外，我们发现并证明长期接触丙烯酰胺可能会诱发斑马鱼和小鼠的 HF。从机制上讲，我们揭示了丙烯酰胺由于线粒体功能障碍和代谢重塑而引起心脏能量代谢紊乱。此外，丙烯酰胺暴露通过抑制NOTCH1-磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信号传导诱导心肌细胞凋亡。此外，丙烯酰胺暴露可能影响生命早期的心脏发育，并且丙烯酰胺暴露的不利影响通过DNA甲基转移酶1（DNMT1）引起的表观遗传变化对下一代构成威胁。在本研究中，我们从基于人群的观察到实验验证，揭示了油炸食品和丙烯酰胺作为一种典型的食品加工污染物对HF的不利影响和潜在机制。总之，这些结果在流行病学和机制上为揭示丙烯酰胺引发HF的机制提供了强有力的证据，并强调了减少油炸食品消费对降低HF风险的重要性。