EasySep™总核酸提取试剂盒来自含有多达1 x 10^6细胞的细胞悬浮液(≤5x 10^6细胞/ml)的核酸。在样品裂解后,easepSep™总核酸急流螺丝™捕获核酸,并使用Erythroclear™磁铁(目录#01737)进行标准和全血的制剂,或96-Well pcr Microplate磁铁(目录#100-100-100-13044)进行96-Well in 96-Well in 96-Well形式。残留蛋白和细胞成分通过用70%乙醇洗涤分离的核酸去除,并使用洗脱缓冲液从Rapidspheres™释放。最终分离的分数包含纯化的核酸,可以立即使用Nanodrop™分光光度计直接定量,额外纯化(例如DNA去除),或用于下游应用。
进行了一项研究以证明富集过程的可重复性。由于三个地点的挑战,通过将多个骨髓瘤细胞系在健康的供体全血中刺激为3 cd138+水平,基于流式细胞仪(低,中,中等,高度,高度代表<3%,3-15%,> 15%,分别为16位副人)进行了研究,该研究是通过将多发性骨髓瘤细胞系刺到健康的全血中,进行了研究。在低水平和中等水平(高水平的4对4)中研究了更多的面板成员,以在更具挑战性的水平上证明富集。在每个站点的两个位点在三个站点评估了可重复性,而连续8天。三个独立站点中的每个站点中的每个站点都从同一面板成员那里获得了6个等分试样(来自16个面板成员)。每个操作员在每个面板成员上使用三个不同的试剂批次进行了富集。完成富集后,将所有样品均给单个操作员,以执行富集和未增强样品的流式细胞仪,以测量CD138+细胞纯度。每天准备了两个不同的CD138频率人为的样本以富集。
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图3。通过免疫™人类CD3/CD28/CD28/CD2 T细胞激活剂EasySep™分散的人T细胞的强大人体T细胞扩展在12天内通过Immunocult™人类CD3/CD28/CD28/CD2 T细胞活化剂在Immunocult™-XF T细胞扩张培养基中补充了人类重新组合IL-2。 在第0天,1 x 10^6 easep™分散的人T细胞用Immunocult™-XF T细胞膨胀培养基中的25 µL免疫™人CD3/CD3/CD3/CD3/CD28/CD2T细胞活化剂,并补充了10 ng/ml的人类重组IL-2。 在第3、5、7和10天,对可存活的细胞进行计数,并加入补充IL-2的新鲜培养基。 在12天的培养期间,未添加其他免疫™人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂(在6个供体的6个实验中,平均值±SD)。通过免疫™人类CD3/CD28/CD28/CD2 T细胞激活剂EasySep™分散的人T细胞的强大人体T细胞扩展在12天内通过Immunocult™人类CD3/CD28/CD28/CD2 T细胞活化剂在Immunocult™-XF T细胞扩张培养基中补充了人类重新组合IL-2。在第0天,1 x 10^6 easep™分散的人T细胞用Immunocult™-XF T细胞膨胀培养基中的25 µL免疫™人CD3/CD3/CD3/CD3/CD28/CD2T细胞活化剂,并补充了10 ng/ml的人类重组IL-2。在第3、5、7和10天,对可存活的细胞进行计数,并加入补充IL-2的新鲜培养基。在12天的培养期间,未添加其他免疫™人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂(在6个供体的6个实验中,平均值±SD)。
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使用嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞进行癌症免疫治疗是一个快速发展的领域,制造这些细胞是一个复杂的过程,需要多个优化步骤。我们已经开发出用于分离、激活和扩增人类 T 细胞的试剂,可用于临床细胞疗法制造。可溶性 ImmunoCult™ 人类 T 细胞激活剂通过交联细胞表面的 CD3 和共刺激分子来诱导 T 细胞活化。然后可以对活化的 T 细胞进行基因改造,随后在无血清和无异种的 ImmunoCult™-XF T 细胞扩增培养基中扩增。在这里,我们介绍了几种使用 ImmunoCult™ 产品的优化策略,以获得高转染效率和最大细胞产量。通过评估 T 细胞的活化动力学并确定最佳转染时间点,可以显著提高 CRISPR/Cas9 和慢病毒介导的基因修饰方法中的转染效率。我们的研究还表明,在激活后第三天将 T 细胞稀释至较低的细胞密度可大大提高细胞活力和累积细胞生长,从而使培养 10 - 12 天后的总人类 T 细胞扩增超过 1000 倍,活力 > 85%。扩增的 T 细胞共表达 CD45RO + CD62L + 。例如,我们应用此处描述的工作流程从健康供体中生成 T 细胞受体 α β (TCR αβ ) 敲除 (KO) T 细胞,敲除效率高达 90%。使用 EasySep™ 人 TCR αβ 耗竭试剂盒可以进一步提高 TCR αβ KO 细胞的纯度。总之,本研究中概述的流程可以轻松快速地实施,以提高 T 细胞制造效率。