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ORANGE：基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑工具箱，用于对神经元中的内源性蛋白质进行表位标记
蛋白质的正确亚细胞分布决定了神经元的复杂形态和功能。荧光显微镜技术对于研究亚细胞蛋白质分布非常有用，但它们在用荧光探针有效可靠地标记内源性蛋白质方面的能力有限。我们开发了 ORANGE：神经元基因组编辑应用的开放资源，它介导啮齿动物分离神经元培养、器官切片和体内表位标签的靶向基因组整合。ORANGE 包括一个用于深入研究内源性蛋白质分布的敲入库、病毒载体和一个详细的两步克隆方案，用于开发针对新靶标的敲入。使用 ORANGE 和（活细胞）超分辨率显微镜，我们揭示了内源性神经递质受体和突触支架蛋白以及以前未表征的蛋白质的动态纳米级组织。最后，我们开发了一种在神经元中创建多个敲入的机制，介导内源性蛋白质的多重成像。因此，ORANGE 能够在纳米级分辨率下量化神经元中几乎任何蛋白质的表达、分布和动态。
内源性钙蛋白酶抑制剂calpastatin减弱了鼠鼠bar综合征的轴突变性
图1内源性HCAST表达可保护急性离体损伤模型中的轴突完整性。三角形（TS）的神经肌肉制剂（WT，n = 3）和Hcast（n = 3）小鼠用抗绞中AB（AGAB）在体内进行内部化研究（A，B），以及（损伤）或没有（对照）正常人（nHs）（nhs）的position（Corsem and Huspect）（CORCE）（CORCE）（cosect）（conterum and）（nhs），以供应（nhs），以供应（nhs），以供介绍。a）WT和Hcast TS运动神经末端（MNT）在37 C下孵育60分钟时，表面AGAB显着降低，而不是0分钟。（b）在用Triton X-100通透性后，在60分钟组中，MNT的总AGAB强度在两种基因型中都恢复正常，这表明AGAB内在化。（c）与对照相比，受伤的WT和Hcast TS的MNT的补体（绿色，E）强度显着增加。（d）神经丝（NF-H，洋红色，E）与对照相比，受伤的WT组织中MNT处的免疫染色强度显着降低，但受到Hcast受伤组织的对照水平的保护。（e）远端神经染色的说明性图像。btx（星号，橙色）和髓磷脂碱性蛋白（MBP，箭头，橙色）分别用于识别Ranvier（Nor）的Mnt和远端节点。虚线的大纲表示没有NF-H染色的位置。比例尺=5μm。 dotplots =平均±S.E.M.在比较治疗效果的数据上进行了未配对的一尾t检验（A，B＆C）； *表示p <.05。双向方差分析比较治疗（对照与损伤）或基因型（WT vs Hcast），然后对D.的数据进行了Tukey的事后多重比较测试。 * p <.05，***表示p <.001
乙酰杆菌中的基因组工程内源性CRISPR/CAS系统，乙酰杆菌和梭状芽胞杆菌自动乙醇
乙细菌可以通过将CO 2转换为工业相关的化学物质和燃料的能力来在净零中发挥重要作用。对该潜力的全面开发将依靠有效的代谢工程工具，例如基于链球菌的链球菌CRISPR/CAS9系统的工具。然而，试图将含Cas9的载体引入木质杆菌的尝试不成功，这很可能是由于Cas9核酸酶毒性的毒性，并且存在内源性a。Woodii限制的识别位点 - cas9 Gene中的Modiiii限制（R -M）系统。作为替代方案，本研究旨在促进将CRISPR/CAS内源系统作为基因组工程工具的开发。因此，开发了一个Python脚本，以自动化杂质的邻近基序（PAM）序列的预测，并用于识别A. woodii I型I型I-B CRISPR/CAS系统的PAM候选。分别通过干扰测定和RT-QPCR在体内表征识别的PAM和本地领导者序列。由本机领导者序列，直接重复和足够的间隔者组成的合成CRISPR阵列的表达，以及用于同源重组的编辑模板，成功地导致了300 bp和354 bp的生成Pyre和Pye和PheA的架子内缺失。为了进一步验证该方法，还产生了3.2 kb的HSDR1缺失，以及在PHEA基因座的荧光激活和吸收转换TAG（快速）报告基因的敲入。同源臂长度，细胞密度和用于转化的DNA量显着影响编辑的效率。随后将设计的工作流应用于梭状芽胞杆菌的I型I-B CRISPR/CAS系统，从而使Pyre的561 bp框架内缺失具有100％的编辑效率。这是使用其内源性CRISPR/CAS系统的A. woodii和C.自身乙烷的基因组工程的第一个报告。
内源性Orexin和dynorphin Corelease对投影定义的腹侧换段多巴胺神经元的明显神经调节作用
神经元通过Orexin 1（OX1R）或Kappa阿片类药物（Kor）受体。鉴于OX1R激活增加了VTA DAFINF，而Kor会减少燃料，因此尚不清楚加冕的肽如何促进DA神经元的净活性。我们测试了对LH OX/DYN神经调节的光刺激是否通过肽释放来释放VTA DA神经元活性，以及基于VTA DA投影靶标（包括基底外侧杏仁核（BLA）（BLA）或内医生或内膜外壳的光学驱动的LH OX/DYN释放的效果。使用电路跟踪，光遗传学和斑块夹电生理学的组合，在男性和女性Orexin Cre小鼠中，我们显示出对VTA DA神经元的LH ox/dyn光学刺激的多样化响应，这不是由快速发射器释放介导的，并被拮抗剂封闭，并被拮抗剂驱动到Kor和Ox1r和Ox1r Signal1r。此外，在VTA中对LH OX/DYN输入的光学刺激抑制了大多数BLA验证的VTA DA神经元的结构，而VTA双向的LH ox/dyn输入的光学刺激会影响lacbsh-或machsh-progenting vta neurons的filtirection。这些发现表明，LH ox/dyn Corelease可能通过在每个人群中平衡神经元的合奏，从而影响VTA的输出，从而有助于寻求奖励的不同方面。
内源性逆转录病毒表达在间皮瘤发育的实验小鼠模型中激活I型干扰素信号
在间皮瘤发育实验模型中，早期事件包括双链RNA（DSRNA）中编辑水平的增加。我们假设内源性逆转录病毒（ERV）的表达有助于DSRNA形成和I型干扰素信号传导。与非肿瘤样品相比，肿瘤的 ERV和干扰素刺激的基因（ISG）表达明显更高。 12个肿瘤特异性ERV（“ Mesoerv1-12”）被鉴定出来并通过qPCR在小鼠组织中验证。 与间皮瘤细胞相比，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的“ Mesoerv1-12”表达较低。 “ Mesoerv1-12”水平通过脱甲基化剂5-Aza-2' - 脱氧胞苷的处理显着提高，并伴随着DSRNA和ISGS的水平升高。 与MEF相比，间皮瘤细胞中的基底ISGS表达更高，并且通过阻断IFNAR1和沉默的MAVS，JAK抑制剂r梭替尼显着降低了。 “ Mesoerv7”启动子在5-Aza-CDR处理后，与假小鼠组织以及间皮瘤细胞以及MEF细胞和MEF相比，在石棉暴露的暴露中被脱甲基化。 这些观察结果发现了石棉诱导的间皮瘤的新颖方面，从而导致ERV表达因启动子去甲基化而引起，并且与DSRNA水平的增加和IFN型信号传导的激活相似。 这些特征对于早期诊断和治疗很重要。ERV和干扰素刺激的基因（ISG）表达明显更高。12个肿瘤特异性ERV（“ Mesoerv1-12”）被鉴定出来并通过qPCR在小鼠组织中验证。与间皮瘤细胞相比，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的“ Mesoerv1-12”表达较低。“ Mesoerv1-12”水平通过脱甲基化剂5-Aza-2' - 脱氧胞苷的处理显着提高，并伴随着DSRNA和ISGS的水平升高。与MEF相比，间皮瘤细胞中的基底ISGS表达更高，并且通过阻断IFNAR1和沉默的MAVS，JAK抑制剂r梭替尼显着降低了。“ Mesoerv7”启动子在5-Aza-CDR处理后，与假小鼠组织以及间皮瘤细胞以及MEF细胞和MEF相比，在石棉暴露的暴露中被脱甲基化。这些观察结果发现了石棉诱导的间皮瘤的新颖方面，从而导致ERV表达因启动子去甲基化而引起，并且与DSRNA水平的增加和IFN型信号传导的激活相似。这些特征对于早期诊断和治疗很重要。
表征 CRISPR 敲入细胞中内源性 Claudin-1 的表达、运动性和对丙型肝炎病毒的易感性。
1 法国国家科学研究院、IRIM 蒙彼利埃传染病研究所，34293 蒙彼利埃，法国 2 蒙彼利埃大学，34090 蒙彼利埃，法国 3 INSERM U1110 – 病毒和肝病研究所 (IVH) 4 斯特拉斯堡大学，67000 斯特拉斯堡，法国 5 斯特拉斯堡大学医院、大学医院研究所肝消化道中心，67000 斯特拉斯堡，法国
对成人内源性神经发生作为脑损伤后脑修复机制的批判意见
创伤性脑损伤（TBI）每年影响超过5000万人（Blaya等，2022），并导致各种功能障碍。取决于损坏的区域，更改可能会损害不同的功能，这可能会随着时间的流逝而恢复。大脑对损伤的反应包括分子，细胞和电路水平的事件（Zepeda等，2004； Lim等，2014； Kang等，2022）。但是，对人类在亚细胞和细胞水平上的塑性反应的研究构成了许多困难。因此，主要通过行为评估以及神经成像和神经生理学研究来评估人类功能的丧失和恢复。在比较人类和啮齿动物（如啮齿动物）中的恢复时，我们只能提出在某些功能但并非所有功能中观察到的事件的潜在贡献（Kozlowski等，2013）。加上使用TBI实验模型作为探索人类神经康复的代理的复杂性，是男性和女性临床和实验人群的结果的不同。Adult neurogenesis, which has been clearly demonstrated in rats and mice (for a review, see Denoth-Lippuner and Jessberger, 2021 ), but not beyond doubt in humans ( Sorrells et al., 2018 ; Moreno-Jiménez et al., 2019 , for a critical review, see Oppenheim, 2019 ) has been explored as a potential mechanism subserving functional recovery after brain damage, but it is our opinion科学界还没有关于其在大脑修复中的潜在作用得出的结论。（2）在何种程度上推断动物在人类中获得的TBI结果？出于这种观点的目的，我们想解决四个主要问题：（1）在TBI的结果中，在大鼠和小鼠的结果中是否存在明确的性别依赖性差异，这些差异反映了人类的TBI结果？（3）神经发生成年小鼠和大鼠的脑回收机制吗？（4）神经发生是成年人脑中不可抑制的机制吗？（1）来自2016年在PubMed的动物模型的临床前研究中，只有7％的TBI研究包括女性，并关注性别差异对临床模型的重要性（Späni等，2018）。临床试验和实验观察结果主要是基于男性人群的结果，这是在女性中荷尔蒙的闪光如何影响结果并因此结果的论点。因此，实验性脑损伤后，激素在恢复中的作用被视为“问题”，而不是接受适当的注意以在恢复过程中揭示其影响。tbi发生在人类男性不同的情况下。在男性中，TBI是在几种类型的接触碰撞或军事战斗的结果后更常见的（Späni等，2018）；在女性中，tbi主要来自跌倒，
利用复杂生物基质中的药物，代谢产物和内源激素的低水平检测的灵敏度提高
在本技术说明中，Sciex 7500系统上的技术创新被利用以提高许多具有挑战性的法医工作流程的灵敏度和总体量化性能。通过比较Sciex 7500系统和上一代仪器QTRAP 6500+系统上观察到的信号来研究这些灵敏度增长的影响。结果显示了检测下限（LLOD）和定量（LLOQ）的改进，这些限制提供了常规，鲁棒检测从具有挑战性的生物矩阵中提取的超低分析物的能力。这种提高的灵敏度还可以使较小的样品和注射体积可显着最大程度地减少矩阵干扰，因此提供了更一致的电离。结果还表明，可以利用增加的灵敏度来简化样本准备程序，从而提高了常规分析的生产率。能够分析这些化合物而无需艰苦且耗时的样本准备程序，提高了整体运营效率和吞吐量，从而使法医测试实验室能够超过其当前的生产率水平。
定量的活细胞成像和计算建模为内源WNT/CTNNB1信号动力学
摘要Wnt/CTNNB1信号传导调节所有多细胞动物的组织发育和稳态，但是潜在的分子机制仍未完全理解。具体而言，缺少对内源性蛋白质行为的定量见解。在这里，我们结合了CRISPR/CAS9介导的基因组编辑和定量活细胞显微镜，以测量在生理和致癌条件下人类细胞中荧光标记，内源性CTNNB1的动力学，扩散特征和绝对浓度。最先进的成像表明，与途径的激活状态无关，CTNNB1的大量CTNNB1驻留在缓慢的细胞质复合物中。当Wnt/ctnnb1被激活时，这种细胞质CTNNB1复合物的大小会大大降低。基于我们的生物物理测量结果，我们构建了WNT/CTNNB1信号传导的计算模型。我们的综合实验和计算方法表明，Wnt途径激活通过三个调节节点调节不同亚细胞隔室的游离和复杂的CTNNB1的动态分布：破坏性复合物，核细胞质式穿梭和核定率。
通过CRISPR-CAS9在人类气道干细胞中靶向更换全长CFTR，以用于内源性基因座的PAN-MONT校正
囊性纤维化（CF）是一种由CF跨膜诱导调节剂（CFTR）蛋白的产生和/或功能受损引起的单基因疾病。尽管我们先前已经显示出对最常见的致病突变的校正，但整个CF基因中还有许多其他致病突变。精确插入CFTR cDNA的自体气道干细胞疗法，无论因果突变如何，几乎所有CF的CFTR基因座都可以为几乎所有CF papentent摄取耐用的治疗方法。在这里，我们使用CRISPR-CAS9和两个与CFTR cDNA的两半相关的病毒（AAVS），在上部机构干细胞（UABCS）和人类bronthial Checepselial Chial Chirial Chips（Hymanthial Chialical Clonial Clonial Clonial Clonial Chilial Chialial Clial Cyselial Chillial Cyselial Chirial Chirial Chillial Clyeclial）（Huncseps）（TCD19）和截断的CD19（TCD19），顺序插入完整的CFTR cDNA（TCD19）。从11个不同的CF供体中获得60％至80％的TCD19 + UABC和HBEC，并从11个不同的CF供体中获得60％ - 80％的TCD19 + UABC和HBEC。在空气界面上培养的分化上皮单层显示出恢复的CFTR函数，在非CF对照中占CFTR函数的70％。因此，我们的研究可以为几乎所有CF患者（包括无法使用最近批准的调节剂疗法治疗的患者）开发治疗。