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EvaGreen® 荧光 DNA 染料
EvaGreen® 荧光 DNA 染色剂的浓度为 100 µM。使用前请彻底旋涡 EvaGreen® 荧光 DNA 染色剂。建议在最终测定中使用 1 - 1.5 µM 的 EvaGreen® 浓度。每次测定时，按照下表所示添加 EvaGreen® 荧光 DNA 染色剂。请注意，在定量 PCR 反应中，预混液的制备可能至关重要，以减少移液误差。在检测仪器上选择 EvaGreen®、SYBR® GREEN 或 FAM 的光学设置。
Qiacuity®onestep AdvancedEvagreen®手册
使用Qiacuity Digital PCR的绝对定量使用终点PCR的过程，但将PCR反应分为数千个单个分区。分区后，某些分区将不包含目标分子的副本，一些分区将包含一个目标分子的一个副本，而其他分子将包含一个以上的目标分子副本。PCR循环后，通过测量跨反应分区的荧光检测到扩增的靶标。由于模板是随机分布的，因此可以使用泊松统计来计算每个有效的可分析分区的目标分子的平均量。通过将每个分区的平均目标DNA量乘以有效分区的数量，可以计算出井的所有分区目标总数。计算目标浓度是通过指代所有可分析分区中的体积（即填充有反应混合物的分区）确定的。 通过反应混合物本身中存在的荧光染料来识别填充分区的总数。 通过DPCR的绝对定量消除了标准曲线的需求，以确定给定样品中目标RNA或DNA的量。计算目标浓度是通过指代所有可分析分区中的体积（即填充有反应混合物的分区）确定的。通过反应混合物本身中存在的荧光染料来识别填充分区的总数。通过DPCR的绝对定量消除了标准曲线的需求，以确定给定样品中目标RNA或DNA的量。
一种新型的微流体上和外的 DNA 扩增增强剂
聚合酶链式反应 (PCR) 和环介导等温扩增 (LAMP) 等核酸扩增方法是强大的分子生物学工具，广泛应用于基础生物学研究、临床诊断、检验检疫等各个领域。为了实时或通过扩增后分析（如熔解曲线分析）检测闭管系统中的 DNA 扩增产物，需要将荧光报告子添加到反应混合物中。1 这些报告子主要分为两类：一类是通常用荧光团标记的特异性 DNA 探针，2 另一类是双链 DNA 结合染料，例如 EtBr、3 SYBR Green I (SGI)、4 EvaGreen、5 和 Sytox Green。6 基于探针的报告系统具有特异性，适用于利用不同荧光团进行多重检测。然而，合成这些双链 DNA 报告子的成本很高，并且需要大量合成。
实时定量PCR优化指南
荧光PCR检测化学物质可以在很大程度上分为两类：基于染料和核酸探针探针的测定。基于染料的检测依赖于DNA结合染料，该染料比在溶液中（例如SYBR®Green，Evagreen®和Syto™染料）中未结合时更强烈地荧光染料。基于染料的检测仅需要在PCR主混合物中添加底漆，因此可以具有成本效益，并且相对简单设计。然而，互化染料将检测反应中产生的任何dsDNA，例如脱靶和非板块放大或引物二聚体，可能导致不准确的定量。变性（熔体）分析可以在PCR之后进行，以区分目标和非构成产品或用于基因型分析。基于染料的PCR不能多重用于定量检测，因为在PCR循环过程中无法区分不同的扩增子。
引文：Pietra D、Brisci A、Rumi E、Boggi S、Elena C、Pietrelli A、Bordoni R、Ferrari M、Passamonti F、De Bellis G、Cremonesi L 和 Cazzola M. Dee
对于 HRM 检测，采用补充表 S1 中报告的优化内含子引物。PCR 在 20 μ L 中进行，其中包含 100 ng DNA、0.5 单位 HotStart Taq 聚合酶以及 1x 缓冲液（Qiagen，德国希尔登）、1.5 mM MgCl 2、800 μ M dNTP、300 nM 每种引物和 1x EvaGreen（Idaho Technologies，犹他州盐湖城）作为插入染料。循环和 HRM 分析在 Rotor-Gene ™ 6000 实时分析仪上进行，采用以下热方案：95°C 持续 15 分钟（一个循环）；95°C 持续 30 秒，55°C 持续 30 秒，72°C 持续 30 秒（50 个循环）；72°C 持续 10 分钟（一个循环）；熔化温度从 85°C 升至 95°C，每秒上升 0.1°C。使用相关的 Rotor-Gene ™ 6000 系列软件 (v1.7.87) 分析数据。标准化条在前导范围的 88°C 和 88.5°C 之间，在尾随范围的 92.5°C 和 93°C 之间，置信阈值为 90%：如果 HRM 图超出了指定参考基因型的置信范围，则软件会将样本识别为变异。图 S1A 显示了健康受试者和 3 名 MPN 患者的 DNA 样本的 HRM 图谱，这些样本先前已通过微电子微芯片分析进行了基因分型（未显示数据）。患者 PV02_113 为 MPL (W515K) 纯合子（TGG>AAG 转换），其 HRM 曲线相对于野生型序列向左移向较低温度，这与纯合变体导致熔解温度 (Tm) 降低的预期一致。患者 PV04_494 为 MPL (W515A) 纯合子（TGG>GCG 转换）等位基因