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World File Search SystemG418
关键的遗传决定因素驱动食道鳞状细胞癌的起始和免疫逃避
Wnt3a，R-Spondin1和Noggin（WRN）调节培养基。15在简短的L-WRN（ATCC CRL-3276）细胞中，在10 cm板上培养了带有培养基（Dulbecco修改的Eagle的培养基[DMEM，Fisher]，0.5 mg/ml G418（Thermofisher），0.5 mg/ml hygromycin b（Hygrofomycin B（Hygroforisher），1％的（生命），（life offermin），/strimies contrymin和1％（life ottercin），（thermofisher）的0.5 mg/mL G418（Thermofisher），/STRECTCILIN（LIFERCTIN），症状（Themerofisher），/症胎牛血清）。在10％的L-WRL细胞（ATCC，CRL-3276）中已在10 cm板中播种在培养基中（没有G418和Hygromycin B），将细胞孵育3-4天。当细胞为80％-90％汇合时，将培养基替换为10 mL新鲜培养基，并将细胞孵育24小时。收集培养基，以1000×g离心4分钟，通过0.22-PM无菌过滤器，并存储在-80°C下。将另外10毫升的新鲜培养基添加到板上并在24小时后收集，以使用相同的步骤使第二批条件培养基。在使用前将第一，第二和第三批条件介质混合在一起，以制备100％WRN条件介质。
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
利用非整合型Wus2载体增强玉米转化和定点诱变
摘要：高效的遗传转化是快速进行基因功能分析和作物性状改良的先决条件。我们最近证明，使用我们的快速农杆菌介导转化方法，具有 NptII /G418 选择和兼容辅助质粒的新型 T-DNA 双元载体可以有效地转化玉米自交系 B104。在这项工作中，我们实施了非整合型 Wuschel2 (Wus2) T-DNA 载体方法进行农杆菌介导的 B104 转化，并测试了其对难转化自交系 B73 转化和基因编辑的潜力。非整合型 Wus2 (NIW) T-DNA 载体辅助转化方法使用两株农杆菌菌株：一株携带目的基因 (GOI) 构建体，另一株提供 NIW 构建体。为了监测 Wus2 与玉米基因组的共整合，我们将由强组成型启动子驱动的玉米 Wus2 表达盒与新的可见标记 RUBY 相结合，后者产生紫色色素甜菜碱。作为 GOI 构建体，我们使用之前测试过的 CRISPR-Cas9 构建体 pKL2359 进行 Glossy2 基因诱变。当 GOI 和 NIW 构建体都由 LBA4404Thy 菌株递送时，B104 转化频率显著提高了约两倍（10% vs. 18.8%）。重要的是，我们能够使用 NIW 辅助转化方法转化顽固性自交系 B73，并通过省略选择剂 G418 获得了三株无转基因编辑植物。这些结果表明，NIW 辅助转化可以提高玉米 B104 转化频率，并为 CRISPR 技术用于无转基因基因组编辑提供一种新选择。
快速且高效的形态学基因介导的六倍小麦转化
成功使用了形态学调节基因，ZM-BABY BOOM（ZMBBM）和ZM-WUSCHEL2（ZMWUS2），用于农杆菌介导的玉米（Zea Mays L.）和高粱（Sorghum Bicolor L.）的玉米转化（Zea Mays L.在这里，我们报告了两种形态学基因介导的小麦转化方法，无论是否有或没有形态学和标记基因切除。这些方法分别产生高达58％和75％的独立转化效率。在这两种情况下，用于产生转基因植物的组织培养时间从80天显着降低到近50天。此外，通过消除了消除胚胎轴切除的需求，绕开了延长愈伤组织形成的双重选择步骤的必要性，从而使该过程减少了劳动密集型，更高的劳动力，更高的劳动力，更高的劳动力，更高的劳动力，更具成本效益。此外，我们证明了这些方法的灵活性，并使用除草剂（磷酸素，乙酰硫磺磺酮）和抗生素（G418）选择了多种基因型的高质量转基因事件。
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。