随着精准肿瘤学中分子诊断领域的不断扩大,迫切需要制定国际标准 (IS) 来协调癌症生物标志物的测量和新技术的实施。使用数字 PCR (dPCR) 和下一代测序 (NGS) 准确检测基因组变异是精准癌症医学的重要组成部分。正确表征临床样本中体细胞单核苷酸变异 (SNV) 和插入/缺失的变异等位基因部分 (VAF) 对治疗决策有重大影响。本报告描述了一项多中心合作研究的结果,该研究评估了三种候选材料协调三种临床相关表皮生长因子受体 (EGFR) 变异测量的能力。候选材料来自基因编辑的癌细胞系,每种材料都含有三种众所周知的 EGFR 变体之一(两种驱动变体和一种抗性变体):EGFR T790M (c.2369C>T)(候选 1;NIBSC 代码 20/194)、EGFR L858R (2573T>G)(候选 2;NIBSC 代码 20/198)和 E746_A750del (c.2235_2249del)(候选 3;NIBSC 代码 20/194)。参与者使用他们常规建立的方法评估了这些材料。总共有 10 个实验室从 4 种方法中返回了 34 个数据集,包括基于 dPCR 和 NGS 的内部和商业分析。两个实验室评估了未稀释的材料,其他实验室评估了各种稀释度的每种材料,以确定它们是否适用于各种变体水平的检测验证或二级标准校准。参与者被要求报告这三种变体的数据,以及这三种材料的任何其他序列变体数据。所有结果均以定量方式报告,以便为每种材料分配共识值。本研究的结论表明,这三种材料都适合用作校准这三种变体的国际标准,并且在 NGS 和 dPCR 中经过验证,VAF 为 100%。此外,这三种候选材料适合稀释以获得较低的 VAF 值。建议:
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图2:通过QTDNA浓度进行定量,如Qubit™BR和Qubit™HS分析所测量。在两个样品体积(2µL和5µL)中测量了10个CTDNA参考标准标准。通过相同的测定测量(BR分析 - 绿色圆圈和三角形; HS分析 - 紫色的平方和倒三角形),两种样品体积之间没有显着差异。然而,当通过HS和BR测定测量相同的样品体积时,结果在统计学上存在显着差异(p <0.05;绿色圆圈与紫色正方形;绿色三角形与紫色倒立三角形)。
福尔马林对自然史标本和组织病理学材料的固定历史上一直被视为成功基因组分析的障碍。然而,专门定制的提取方法的开发是与重度交联的档案构成抗衡的,将数百万先前被忽视的标本重新连接为可行的分子资产。在这里,我们提出了一种易于遵循的方案,用于筛选档案湿标本,用于分子活力和随后的基因组DNA提取,适合测序。该协议始于对标本降解和保存介质条件的非破坏性评估,使博物馆策展人和研究人员都可以选择在短阅读DNA测序期间最有可能产生可接受的比例(20-60%)的内源性DNA的标本。提取方案在缓冲液中使用热碱性裂解(0.1M NaOH,1%SDS,pH 13),同时裂解组织并脱离组织。为了最大程度地提高DNA恢复,苯酚:氯仿提取与小碎片优化的Spri Bead清洁结合。适用于保存完好的档案组织,该方案可以产生每50 mg组织的1-2μgDNA,其平均碎片大小通常在50-150 bp的范围内,该尺寸适合恢复足以恢复足够的基因组DNA,足以重建完整的线粒体基因组并获得高达25X核基因组的覆盖率。我们提供了向参考基因组读取映射的指导,并讨论了依靠小片段进行SNP基因分型和从头基因组组装的局限性。该协议为历史标本的更广泛的遗传和系统发育分析打开了大门,有助于更深入地了解进化趋势和适应性,以响应不断变化的环境。
Agilent Femto Pulse 系统的革命性设计使其成为唯一能够自动对高分子量 (HMW) gDNA 进行脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析的仪器。与 PFGE 分析相比,Femto Pulse 系统能够在极短的时间内对 gDNA 大小和完整性进行定性分析。第三代测序或长读测序平台在从小型基因组分析到复杂基因组从头组装等各种应用方面的进步,对 HMW gDNA 样本提出了高质量标准。有多种方法可用于从真核和原核来源中分离 gDNA,这些方法针对特定的下游应用量身定制。因此,分离的 gDNA 的大小和质量会受到不同提取方法的影响,因此需要对 gDNA 样本进行可靠的质量评估。Agilent 基因组 DNA 165 kb 试剂盒专为在 Femto Pulse 系统上分离 HMW gDNA 而设计,可提供准确且可重复的大小和质量评估。使用 Femto Pulse 系统上的五种不同 gDNA 提取方法和基因组 DNA 165 kb 分析对 gDNA 的大小和质量进行了比较。
摘要。高质量基因组DNA(GDNA)的分离是植物分子生物学中的一种关键技术。GDNA的质量决定了实时聚合酶链反应(PCR)分析的可靠性。在本文中,我们报告了针对各种植物物种中实时PCR优化的高质量GDNA提取方案。在96孔块中执行,我们的协议提供了高吞吐量。不需要苯酚 - 氯仿和液氮或干冰,我们的方案比传统的DNA提取方法更安全,更具成本效益。该方法需要10毫克的叶片组织才能获得5-10μg高质量的GDNA。光谱测量和电泳用于证明GDNA纯度。提取的DNA在限制酶消化法和常规PCR中有资格。实时PCR扩增足以以非常低浓度(3 pg/μl)检测GDNA。我们的无苯酚 - 氯仿方案的GDNA稀释液标准曲线显示出比苯酚 - 氯仿方案更好的线性(R 2 = 0.9967)(R 2 =
Agilent 2200 TapeStation 系统与 Agilent 基因组 DNA ScreenTape 检测相结合,为评估 gDNA 起始材料的数量和完整性提供了极佳的解决方案。但是,为了更直接地测量 gDNA 完整性,以及标准化完整性测量,已经为基因组 DNA ScreenTape 检测开发了一种软件算法。基于对大约 7,000 个不同 gDNA 样本的分析,该算法提供了 gDNA 完整性的数值评估,称为 DNA 完整性数值 (DIN)。此功能与 TapeStation 分析软件(修订版 A.01.05 或更高版本)相结合,可自动确定并显示 DIN 作为 gDNA 完整性的衡量标准。使用旧版本软件生成的数据文件可以在软件升级后重新分析以确定 DIN。
图4在早期检测设置中CFDNAME得分的灵敏度和特异性。在所有样本中或具有较低或更高GDNA污染的样本中都证明了所有度量。gDNA污染,并计算了一个比率(见图S3)。的样品高于中值CfDNA/gDNA比率较低,反之亦然。(a)UKFOCS样本中CFDNAME得分的特异性。(b)所有卵巢癌患者中CFDNAME评分的敏感性,(c)来自高危卵巢癌患者的样本,或(D)高危卵巢癌患者的样本,<诊断为1年。对于具有匹配的CA125数据的样品,CFDNAME,CA125和组合得分(当CFDNAME或CA125呈阳性时为阳性)在(E)所有癌症或(F)高风险癌症中,无论GDNA污染如何。CA125和组合得分重叠,可能是由于样本量较小的数据量有限。(g,h)评估CA125负面样本中的灵敏度和特异性,包括所有或仅是高风险癌症。
开发非模型物种的高分子量 (HMW) 基因组 DNA (gDNA) 提取方案对于充分利用长读测序技术以生成有助于解答有关这些生物的复杂问题的基因组组装至关重要。获取足够的高质量 HMW gDNA 对这些物种来说可能具有挑战性,尤其是对于富含多糖的组织,例如来自葡萄藻属内物种的生物质。基于柱式 DNA 提取和生化裂解试剂盒的现有方案效率低下,并且由于生物质多糖含量的变化可能没有用。我们开发了一种优化的方案,用于从葡萄藻生物质中有效提取 HMW gDNA,以用于长读测序技术。该方案利用山梨糖醇作为初始洗涤步骤去除多糖,并产生浓度高达 220 ng/μL 的高纯度 HMW gDNA。然后,我们证明了从该方案中分离出的 HMW gDNA 适用于在 Oxford Nanopore PromethION 平台上对三种葡萄藻进行长读测序。我们的方案可用作在富含多糖的微藻中高效提取 HMW gDNA 的标准,并可适用于其他具有挑战性的物种。