使用基因靶向技术创建的抽象基因工程动物长期以来一直被认为是探索感兴趣基因功能的有益,有效和有价值的工具,至少至少在2013年初。然而,这种方法遭受了费力且耗时的任务,例如成功靶向胚胎干细胞(ES)细胞的产生,其表征,携带这些基因修饰ES细胞的嵌合胚泡的产生,以及将操纵囊肿的人移植到受体(Pseudopopeprepepregnant)的女性中,将其移植到chimericers中。由于基因组编辑技术的出现(现在是CRISPR/ CAS9系统的例证)在2013年底,通过基因组编辑成分的前核微介入(MI)在基因组编辑的动物的产生中取得了重大进展,将成分纳入受精的彩蛋(Zygotes)或Zygotes中的Zygotes中。但是,这些程序要求将基因组编辑的胚胎转移到受体女性的生殖道中,以进行进一步发展。通过卵形核酸递送(GONAD)及其修饰的版本(称为“改进的性腺(I-Gonad)”的基因组编辑是作为MI-EP或EP基因组基因组编辑的动物生产的一种替代方法,现在被认为是非常方便的基因组编辑,仅在vivo中表现出lum un lum curvical invi vivo。该系统还可以同时转染卵形腔内的上皮细胞。在这篇综述中,我们总结了性腺/ I -Gonad及其衍生物的最新进展,并讨论了这些技术研究与女性繁殖有关的各种生物系统的潜力。
这个研讨会的一个主要目标是为每个学生提供新浸渍的动物,每天下午执行性腺手术,直到他们取得成功。EGFP mRNA用于性腺电穿孔,并获得了荧光胚胎的成功。到此,每天早晨,在性腺手术后,从与特定学生外科医生相关的单个小鼠中分离出卵,并分析荧光。由研讨会结论,所有学生都成功地产生了发光的胚胎。此外,由于大量的女性,外部讲师(Gurumurthy博士和Williams博士)以及供应商(来自BEX Inc.)能够成功执行该技术。显微注射,在整个课程中,两个带有Zygotes的微注射系统可供学生在教师监督下利用作为此技术的介绍。
应用于产生基因组编辑的大鼠,包括白化病sprague-dawley和白化病刘易斯大鼠(但是,不是有色的棕色挪威[bn]大鼠)。我们观察到成功的I -Gonad取决于所使用的小鼠菌株。例如,在随机繁殖小鼠(例如ICR和C3H/HE×C57BL/6)中,它在相对严格的电气条件下成功,但在C57BL/6菌株中却没有成功。在不太严格的条件下,I -Gonad在C57BL/6菌株中取得了成功。我们推测使用BN大鼠对I -Gonad也是如此。在应用> 500 mA的电流时,我们未能获得大鼠后代(胎儿/新生儿);但是,使用NEPA21(NEPA基因)在100-300 Ma下I-Gonad导致基因组编辑的BN大鼠的产生,其效率为75%-100%。同样,使用CUY21EDIT II(BEX Co.)在150-200 Ma的电流下,I-Gonad导致基因组编辑的BN大鼠的产生,其效率为24%-55%。这些实验表明,在执行I -Gonad时,根据所使用的大鼠菌株选择适当的电流值的重要性。
摘要:特异性抗体对于蛋白质复合物的细胞和组织表达、生化和功能分析必不可少。然而,制备特异性抗体通常费时费力。将内源性蛋白质的表位标记在适当的位置可以克服这个问题。在这里,我们使用 AlphaFold2 蛋白质结构预测研究了表位标签位置,并结合 CRISPR-Cas9 基因组编辑和电穿孔 (i-GONAD) 开发了 Flag/DYKDDDDK 标签敲入 CaMKII α 和 CaMKII β 小鼠。使用 i-GONAD,可以将长达 200 bp 的小片段插入目标基因的基因组中,从而实现高效便捷的小表位标记。使用市售的抗 Flag 抗体进行实验,可以通过蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫组织化学轻松检测内源性 CaMKII α 和 β 蛋白。我们的数据表明,通过 i-GONAD 生成 Flag/DYKDDDDK 标签敲入小鼠是一种有用且方便的选择,特别是在没有特定抗体的情况下。
CRE/ LOXP系统是体内基因功能研究的强大工具。CRE重组酶的调节表达以空间和时间控制的方式介导了遗传因素的精确缺失。尽管该系统具有鲁棒性,但仍需要大量精力为每个感兴趣的单个基因创建有条件的敲除模型,在这些基因中,必须同时将两个LOXP位点插入顺式。当前的工作涉及劳动密集型胚胎(ES)细胞 - 基于基因靶向小鼠胚胎的基因和乏味的微观畅通。该工作流的复杂性构成了技术挑战,因此限制了有条件遗传学的更广泛应用。在这里,我们通过将CRISPR供体的独特设计与新的Oviduct电穿孔技术I I -Gonad集成了一种替代方法来生成鼠标LOXP等位基因。显示了这种方法的潜力和简单性,我们在一次尝试中创建了五个基因的FloxErx等位基因,其成本相对较低,设备设置最少。除了条件等位基因外,还获得了本构敲除等位基因作为这些实验的副产品。因此,I -Gonad的更广泛应用可能会使用新型鼠模型促进基因功能研究。
多核苷酸,正如普遍的分子,在生理上分布在所有组织中。内源性多核苷酸样衍生物通过受损或垂死的细胞以及在缺氧1-3的条件下在细胞外空间中在生理上释放。外源性多核苷酸是从饲养人类食用的鳟鱼的性腺DNA中提取的,并用高温灭菌程序纯化,以获得没有药理和过敏性蛋白质污染物1的纯成分1。多亏了采用的高级程序,本文档章节中讨论的高度纯化的多核苷酸是使用首字母缩写PN-HPT™(多核苷酸高度纯化的技术)。一家意大利公司Mastelli SRL获得了专利的PN-HPT™Technologies,并于2004年从意大利的Trout Gonad DNA介绍了第一家基于PN-HPT™的医疗设备。PN-HPT™基于Mastelli的最高标准生物技术的基于60年以上的精致的医疗设备,如今已在全球30多个国家 /地区分发。高科技PN-HPT™纯化程序消除了蛋白质污染物的所有风险。Mastelli是第一家根据世界级GMP和QA标准来控制整个生产链的公司,从鳟鱼育种和PN-HPT™纯化到可固定的PN-HPT-HPT™基于货架的医疗设备。多年来,PN-HPT™设备的演变一直稳定,直到最新®(专利EP 2 407 147 B1-具有生物再生的成分,
cho,cho-1,cho-k1(上皮,内皮,转染的融合蛋白) L929(成纤维细胞,转染)NIH/3T3,3T3(成纤维细胞)HFOB 1 .19,Mg63(成骨细胞细胞系)MM41(骨骼肌细胞,骨骼肌母细胞,转染,转染)RAW 264 .7(巨噬细胞)(巨噬细胞;骨晶体差异777) (淋巴细胞)U266(淋巴细胞)U937(单核细胞)乳腺癌细胞(已建立的细胞系)HEPG2(HEPATOCYTE)RTG-2(RAINBOW TROUT GONAD细胞)LNCAP LNCAP(前列腺癌细胞系)H1299(转染 - 非毛孔Lung carcly carcl lung carccinoma)(转染)CAC2C CARCACNOMA CAC2C CAC2C CAC2C CAC2C CAC299 MDA-MB-231 MDA-MB 435 PC-3,PC-12 SH-SY5Y SK-MEL-28
摘要:斑马鱼是一种成熟的研究生物,为我们理解脊椎动物组织和器官的发育做出了许多贡献,但我们对调节性腺发育、性别和生殖的基因的理解仍然存在重大差距。与许多器官(如大脑和心脏)在发育的最初几天内形成的发育不同,斑马鱼性腺直到幼虫阶段(受精后 ≥ 5 天)才开始形成。因此,正向遗传筛选已确定了极少数性腺发育所需的基因。此外,识别性腺中表达基因的大量 RNA 测序研究没有足够的分辨率来定义可能在这些器官的发育和功能中发挥重要作用的小细胞群。为了克服这些限制,我们使用单细胞 RNA 测序来确定从幼年斑马鱼卵巢中分离的细胞的转录组。这得到了 10,658 个生殖细胞和 14,431 个体细胞的图谱。我们的生殖细胞数据代表了从生殖系干细胞到早期减数分裂卵母细胞的所有发育阶段。我们的体细胞数据代表了所有已知的体细胞类型,包括卵泡细胞、卵泡膜细胞和卵巢基质细胞。进一步分析发现,在这些广义的细胞类型中,存在数量出乎意料的细胞亚群。为了进一步确定它们的功能意义,我们确定了这些细胞亚群在卵巢内的位置。最后,我们使用基因敲除实验来确定 foxl2l 和 wnt9b 分别对卵母细胞发育和性别决定和/或分化的作用。我们的结果揭示了斑马鱼卵巢发育和功能的新见解,转录组谱将为未来的研究提供宝贵的资源。