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在大豆中的CRISPR质量表达，用于简化planta
摘要 - 这项工作的目的是开发一种在大豆（Glycine Max）胚胎中创建和验证CRISPR-CAS系统和不同GRNA的方法。两个模型基因用于用一个GRNA或部分基因缺失的简单突变。通过使用经典限制酶克隆方法将启动子 + grna2插入CRISPR转换向量中，或通过将启动子 + GRNA2取代和插入启动子 + GRNA2。向量成功地构造了一个和两个grnas。大豆中的农杆菌介导的瞬时转化是为了测试GRNA和系统本身的质量（表达盒）。通过酶消化后DNA富集后转化的胚胎中检测到了简单的突变和基因缺失，然后是聚合酶链反应和测序，这表明CRISPR-CAS系统和指南在起作用。该方案可用于加速基于CRISPR的基因组编辑策略，用于大豆的遗传转化。
利用 CRISPR 敲除八氢番茄红素去饱和酶基因
在新型植物育种技术 (NPBT) 中，CRISPR/Cas9 系统是用于靶基因编辑的有用工具，可快速改良植物的性状。该技术允许同时靶向一个或多个序列，以及通过同源定向重组引入新的遗传变异。然而，CRISPR/Cas9 技术对于某些多倍体木本植物来说仍然是一个挑战，因为必须同时靶向需要突变的所有不同等位基因。在这项工作中，我们描述了改进的方案，使用农杆菌介导的转化将 CRISPR/Cas9 系统应用于高丛蓝莓 (Vaccinium corymbosum L.)。作为概念验证，我们靶向编码八氢番茄红素去饱和酶的基因，该基因的突变会破坏叶绿素的生物合成，从而可以直观评估敲除效率。离体培养的蓝莓 cv. 的叶片外植体。 Berkeley 已用 CRISPR/Cas9 构建体进行转化，该构建体包含两个针对 pds 两个保守基因区域的向导 RNA（gRNA1 和 gRNA2），随后在富含卡那霉素的选择培养基中维持。在选择培养基中培养 4 周后，分离出卡那霉素抗性株系，并通过 Sanger 测序对这些株系进行基因分型，结果显示基因编辑成功。一些突变株系包括白化表型，即使两种 gRNA 的编辑效率都很低，gRNA1 的编辑效率在 2.1% 到 9.6% 之间，gRNA2 的编辑效率在 3.0% 到 23.8% 之间。这里我们展示了一种非常有效的高丛蓝莓商业品种“伯克利”的不定芽再生协议，以及在 Vaccinium corymbosum L. 中使用 CRISPR/Cas9 系统的进一步改进，为通过生物技术方法介导的育种开辟了道路。
94 个 CRISPR-Cas9 表达 T0 转基因烟草株系的基因编辑谱揭示了目标基因的高嵌合编辑频率
摘要：嵌合编辑是基因编辑中经常报道的技术。为了评估嵌合编辑的普遍情况，我们构建了携带标记β-葡萄糖醛酸酶基因（gusA）的转基因烟草品系，并将CRISPR-Cas9编辑载体引入转基因烟草品系中以敲除gusA，然后研究T0代及后续代中gusA的编辑效率。编辑载体携带一个由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的Cas9基因，以及两个引导RNA，gRNA1和gRNA2，分别由拟南芥U6（AtU6）和U3（AtU3）启动子驱动。两个gRNA被设计用于敲除gusA编码区的一个42个核苷酸的片段。利用农杆菌介导的转化和潮霉素选择将编辑载体转化到含有gusA的烟草叶中。使用抗潮霉素的独立 T 0 转基因株系通过组织化学 GUS 测定、聚合酶链式反应 (PCR) 和 PCR 扩增子的下一代测序来评估 gusA 编辑效率。94 个 T 0 转基因株系的靶序列图谱显示，这些株系是由未经编辑的细胞再生而来的，随后进行了编辑，并在再生期间或之后在这些株系中产生了嵌合编辑细胞。其中两个株系的 42 bp 核苷酸对的靶片段被去除。详细分析表明，在 4.3% 和 77.7% 的 T 0 转基因株系中分别发现了 AtU6-gRNA1 位点和 AtU3-gRNA2 位点的靶突变。为了解决 T 0 株系中编辑效率极低的问题，我们从嵌合株系进行了第二轮芽诱导，以提高获得所有或大多数细胞都经过编辑的株系的成功率。 T 0 转基因系中的突变谱为理解利用组成型表达的 CRISPR-Cas9 和 gRNA 进行植物细胞中的基因编辑提供了宝贵的信息。