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使用 TrueDesign 基因组编辑器中的长插入工作流程将 GFP 序列插入 TRAC 基因座
8. TrueDesign 基因组编辑器将显示优先设计为最接近预期编辑位置（最多 40 bp 距离）的 gRNA 和供体 DNA。gRNA 距离编辑位置越远，敲入效率越低。所有设计的供体 DNA 序列（现在包括同源臂）都将接受 GeneArt 基因合成制造可行性检查。如果供体 DNA 未通过检查，您将无法选择该 gRNA，并且该行将变灰。在这种情况下，请选择不同的 gRNA 或 TALEN 对（如果可用），或更改插入位置或同源臂长度。对于每个 CRISPR-Cas9 gRNA 和 TALEN 对，可以通过单击供体 DNA 列中的眼睛图标来查看供体 DNA 序列。要在您选择的克隆软件中查看和注释供体 DNA 序列，请单击供体 DNA 列中的下载图标下载 FASTA 文件。确保供体 DNA 位于框架内以实现 GFP 的最佳表达。
多重引导RNA表达系统及其对植物基因组工程的功效
摘要背景：化脓性链球菌 CRISPR 系统由 Cas9 内切酶 (Sp Cas9) 和含有靶标特异性序列的单链向导 RNA (gRNA) 组成。理论上，Sp Cas9 蛋白可以切割与基因组中结合的 gRNA 一样多的靶标位点。结果：我们引入了一种无 PCR 的多 gRNA 克隆系统来编辑植物基因组。该方法包括两个步骤：（1）在 pGRNA 载体中的 tRNA 和 gRNA 支架序列之间克隆两个单链寡核苷酸片段的退火产物，该片段的每条链上都含有互补的靶标结合序列；（2）使用 Golden Gate 组装方法将来自几个 pGRNA 载体的 tRNA-gRNA 单元与含有 Sp Cas9 表达盒的植物二元载体组装在一起。我们通过进行靶向深度测序验证了多重 gRNA 表达系统在野生烟草（Nicotiana attenuata）原生质体和转化植物中的编辑效率和模式。Sp Cas9-gRNA 的两次近端切割大大提高了编辑效率，并在两个切割位点之间诱导了较大的缺失。结论：这种多重 gRNA 表达系统能够高通量生产单个二元载体，并提高植物基因组编辑的效率。关键词：CRISPR-Cas9、金门组装、多重 gRNA、植物基因组编辑
使用 MAD7TM 在大肠杆菌中进行基因编辑的快速入门指南
如果 MAD7 和 gRNA 由不同的载体编码，则可以依次（MAD7 然后是 gRNA）或同时将其转化为细胞。如果 MAD7 和 gRNA 在同一个载体中，只需将载体转化为细胞即可。根据需要进行基因编辑实验。注意：如果进行精确编辑，则需要 DNA 供体模板。DNA 供体可以是化学合成的单链 DNA (ssDNA) 或双链 DNA (dsDNA)，也可以克隆到表达 gRNA 的载体中。5' 和 3' 同源臂的长度取决于所需精确编辑的长度，可能需要针对您的系统进行优化。此外，Lambda Red（或其他重组酶）必须与 MAD7 共同表达才能实现最佳重组。
技术数据表：U-87 mg DCAS9-KRAB单元线
图3。抑制p53和KRAS基因表达。慢病毒表达靶向p53和KRAS基因的GRNA用于感染U-87 mg DCAS9-KRAB细胞。慢病毒没有GRNA表达作为对照。感染后24小时，将抗生素添加到培养基中，以富集抗生素耐药细胞。细胞颗粒并进行DDPCR基因表达定量分析。在感染GRNA的细胞中，p53和KRAS基因的表达显着抑制。
使用 CRISPR 条形码作为分子钟，以单细胞分辨率捕捉动态过程
图 1. a. 带有 poly-A 读数的动态条形码示意图。b. 实验装置的示意图。c. 基于突变特征的条形码比例，结合两个系统的数据：对具有完整 PAM 基序的原型间隔物进行编辑（活性）；不存在 PAM 基序（非活性）；和未切割的 gRNA（原始）。d. 不同 gRNA 中原始条形码随时间的比例。e. 考虑不同 gRNA 之间的错配、间隙和间隙延伸，条形码随时间的变化。f. 具有 21 bp 间隔物（左）或 26 bp 间隔物（右）的 gRNA 的原始条形码随时间的比例。箱线图按不同时间点的平均间隔物长度着色（Cas9 系统）。g. 原始核苷酸随时间变化的百分比，将间隔物相对于 PAM 序列对齐（Cas9 系统）。h。考虑到按 Cas9 版本分类的所有不同 gRNA，C>T 突变随时间变化的百分比。对于所有箱线图，箱线表示四分位距 (IQR)，每个箱线内的水平线表示中位数。
具有有限脱靶效应的双 gRNA 方法可在体内纠正 C9ORF72 重复扩增
设计。我们为所有实验设置了阳性和阴性对照，并根据阳性和阴性对照的表现包括或排除数据点。我们使用 SPSS 来评估数据是否符合统计方法的假设，如果假设不满足，我们将调整为其他统计方法。生物复制是对生物学上不同的样本进行平行测量以捕获随机的生物学变异，这与技术复制不同，技术复制是对同一样本进行重复测量，代表多个独立测量。在免疫印迹、Southern 印迹和 GUIDE-seq 测定中，重复次数是指独立的细胞培养。对于体内和体外 RNA 焦点测量，重复次数是指
CRISPR-CAS裂解测定
研究人员经常依靠Silico CRISPR计算设计算法来产生高性能的GRNA，但仍会在体内经历编辑故障。我们的另一个客户就是这种情况，一个研究团队开发了转基因无菌男性蚊子来打击疟疾的传播。他们的基因编辑实验经常失败，导致大量延迟，每个失败的实验都将项目恢复了8到12个月。在此问题上与他们合作，我们使用CRISPR Analytics平台来量化两个GRNA候选者的扩增子裂解活性。数据表明，两个GRNA都表现出裂解活性在远高于阴性对照的水平上，其中一个GRNA显示出大约是另一个活性的两倍（图2A）。
多重、单细胞 CRISPRa 筛选细胞类型特异性调控元件
基于 CRISPR 的基因激活 (CRISPRa) 是一种通过以组织/细胞类型特异性的方式靶向启动子或增强子来上调基因表达的策略。在这里，我们描述了一个实验框架，该框架将高度多路复用的扰动与单细胞 RNA 测序 (sc-RNA-seq) 相结合，以识别细胞类型特异性、CRISPRa 响应的顺式调控元件及其调控的基因。将许多 gRNA 的随机组合引入许多细胞中的每一个，然后对其进行分析并分成测试组和对照组，以测试 CRISPRa 对增强子和启动子的扰动对邻近基因表达的影响。将该方法应用于 493 个 gRNA 文库，这些 gRNA 靶向 K562 细胞和 iPSC 衍生的兴奋性神经元中的候选顺式调控元件，我们识别出能够特异性上调预期靶基因且 1 Mb 内没有其他邻近基因的 gRNA，包括导致神经元中六种自闭症谱系障碍 (ASD) 和神经发育障碍 (NDD) 风险基因上调的 gRNA。一致的模式是，单个增强子对 CRISPRa 的响应受细胞类型的限制，这意味着成功激活基因依赖于染色质景观和/或其他反式因子。本文概述的方法可能有助于大规模筛选以细胞类型特异性方式激活基因的 gRNA。
Leptomonas pyrrhocoris的完整微圆基因组揭示了其非典型的线粒体RNA编辑事件的来源
尿苷插入 /缺失（U-Indel）编辑Mito-Condrial mRNA，Protistan类Kine-toplastea独有的，生成规范和潜在的非生产性编辑事件。虽然分子机制和为U-Indel编辑提供所需信息的指南（G）RNA的作用有充分的了解，但对不限制其明显易错的性质的力鲜为人知。对GRNA的分析：mRNA对允许在给定线粒体转录的给定位置解剖编辑事件。一个完整的GRNA数据集，与包括非平均编辑转录物在内的完全表征的mRNA群体配对，将允许在整个小节转录组中全球进行此类分析。为了实现这一目标，我们组装了67个昆虫寄生虫Lep- tomonas pyrrhocoris的微量圆，每个微圆通常编码一个位于两个不同来源的两个相似单元之一中的一个GRNA。在相对较低的注释的grnas中，我们已经解剖了L. pyrrhocoris中的所有识别线粒体编辑事件，其菌株在各个微量圆形类别的丰富度上截然不同。我们的资产支持一个模型，其中许多编辑事件由有限的GRNA驱动，而自发的GRNA具有指导规范和非统计编辑的固有能力。
CRISPR/Cas12a (Cpf1) 引导RNA序列的鉴定
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）或 CRISPR 相关（Cas）系统已成为一种主要的基因编辑工具。使用 CRISPR 进行基因编辑需要 Cas 蛋白和相应的向导 RNA（gRNA）。然而，低切割效率和脱靶效应会阻碍 CRISPR/Cas 系统的应用。因此，确定特定的 gRNA 至关重要。在生物传感器应用中，由于 Cas12a（Cpf1）的反式切割活性，CRISPR/Cas12a 可以增强识别靶基因的特异性和灵敏度。mtDNA D 环序列是 mtDNA 中最易变的部分，使其适合区分物种。因此，本研究的目的是通过计算机模拟确定野猪 mtDNA D 环的 gRNA 序列。在 GenBank 数据库的帮助下，使用 Benchling 应用程序预测候选 gRNA。随后，使用 BLAST 核苷酸对 gRNA 候选物进行同源性差异分析，并使用 Jalview 进行错配测试。在几个候选物中，候选物 1 被选为最佳选择，脱靶值为 99.8。与竞争对手的同源性差异分析和与 Sus 属的错配测试分别产生了较高的 E 值和较高的百分比值。这表明候选物不会识别其他物种，但可以检测 Sus scrofa 物种的成员。这些 gRNA 候选物可以选择性地且灵敏地应用于生物传感器，以检测肉类掺假。