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crispr删除SVA逆转录座子在TRPV1/TRPV3属基因间区域的顺式调节元件
摘要：正弦 - vntr- Alu（SVA）逆转录子是仅在灵长类动物基因组中存在的可转座元素（TES）的子类。te插入可以作为顺式调节元素（CRES）选择；但是，使用生物信息学方法和报告基因测定法证明了SVA的调节潜力。这项研究的目的是证明通过CRISPR（群集间隔间隔短的腔粒重复序列）的SVA顺式调节活性），并随后测量直接对局部基因表达的影响。我们识别了17染色体上的一个区域，该区域富含人类特异性SVA。在该区域的比较基因表达分析揭示了多个人体组织中TRPV1和TRPV3的共表达，这在小鼠中未观察到，这突出了两种物种之间的关键调节差异。此外，TRPV1和TRPV3编码序列之间的基因间区域包含位于TRPV3启动子和TRPV1 3'端的上游的人类特定的SVA插入，该插入trpv1的3'端，强调了该SVA作为研究其潜在的CIS -CIS-候选者对这两种基因的候选者。首先，我们生成了SVA报告基因构建体，并证明了它们在HEK293细胞中的转录调节活性。然后，我们设计了一种双目标CRISPR策略，以促进整个SVA序列的删除，并生成编辑的HEK293克隆细胞系，其中包含纯合和杂合SVA缺失。在编辑的纯合∆ SVA克隆中，我们观察到TRPV1和TRPV3 mRNA表达的显着降低，与未经编辑的HEK293相比。此外，我们还观察到杂合∆ SVA克隆中mRNA表达水平的变异性增加。总体而言，在具有SVA缺失的编辑的HEK293中，我们观察到对TRPV1和TRPV3的共表达的中断。在这里，我们提供了人类特异性SVA的示例，其原位调节活性，支持SVA逆转座子的作用，是物种特异性基因表达的贡献者。
PRR 筛查服务传单
InvivoGen 的可定制 PRR 筛选服务使用经过改造的 HEK293、THP-1 或 A549 报告细胞来检测关键免疫通路的激活剂或抑制剂。我们的定制检测采用 SEAP 和/或 Lucia® 荧光素酶报告基因来评估 NF-κB 和 IRF 通路活性，可提供精确的数据，加速先导化合物的发现。
使用现象细胞绘画和多机械染色试剂盒的表型歧视。
我们的hostDetect CHO（DXMDX-RGT-1003），HEK293（DXMDX-RGT-1004）和E.COLI（DXMDX-RGT-1005）PCR DNA量化集成了Chemagic™DNA DNA DNA提取和实时PCR技术，可从示例中提供无缝的工作流程，而不是3小时。受益于简化的检测过程，该过程有助于加速生物制剂或CGT产品开发和纯化时间表，并增强纯度和安全性。
使用液滴数字聚合酶链反应
重组腺相关病毒（RAAV）是通常用于基因治疗的病毒载体。残留的宿主细胞DNA是一种与感染和致癌性风险有关的杂质。因此，需要对其进行监控以进行质量控制。我们旨在开发针对18S核糖体RNA（RRNA）基因的液滴数字聚合酶链反应（DDPCR）方法，以定量残留宿主细胞DNA。使用两组共享C-末端的启动对确定18S rRNA基因的拷贝数。对于将18S rRNA基因的拷贝数转化为基因组DNA的质量浓度，HEK293基因组DNA中18S rRNA基因的准确拷贝数通过与三个参考基因的拷贝数（EIF5B，DCK和HBB的拷贝数进行比较）确定。结果表明，回收了88.6–97.9.9％的HEK293基因组DNA，被回收到RAAV制剂中。将基于DDPCR的分析应用于RAAV制剂，以定量残留的宿主细胞DNA作为杂质。我们的发现表明该测定可用于RAAV产品中残留宿主细胞DNA的定量和尺寸分布。
EP0402 TAQ DNA聚合酶（rec。）
图3。准备和使用病毒载体在靶细胞中重组蛋白表达。（1）包装细胞（例如HEK293）用编码感兴趣基因和必要病毒蛋白的三个或四个质粒转染。（2）将病毒组装在包装细胞中，然后收获和纯化。（3）该病毒用于转导靶细胞，释放感兴趣的基因。（4）在此示例中，将慢病毒载体的RNA反向转录为DNA，将DNA整合到宿主基因组中以进行重组蛋白表达。
微生物从宠物店到实验室繁殖的斑马鱼的传播揭示了一种致病性Birnavirus
新的免疫检查点正在出现，以提高对免疫药物的反应率。由于参与肿瘤微环境的免疫抑制，腺苷A 2A受体（A 2A R）被提议作为免疫发育的靶标。封锁2A R可以恢复肿瘤免疫力，从而改善患者的预后。在这里，我们描述了通过噬菌体显示的人A 2A R（HA 2A R）的有效，选择性和抑制肿瘤抗体拮抗剂的发现。We con- structed and screened four single-chain variable fragment (scFv) libraries—two synthetic and two immunized—against hA 2A R and antagonist-stabilized hA 2A R. After biopanning and ELISA screening, scFv hits were reformatted to human IgG and triaged in a series of cellular binding and functional assays to identify a lead candidate.铅候选者TB206-001散布了HA 2A R-Over表达HEK293细胞的纳摩尔结合；与小鼠和cynomolgus a 2a r的交叉反应性，但不是人类A 1，2b或3受体； HA 2A R在HA 2A R-r-evercress表达HEK293细胞和外周血单核细胞（PBMC）中的功能拮抗作用；结肠肿瘤的HUCD34-NCG小鼠中的肿瘤抑制活性。鉴于其治疗特性，TB206-001是将其纳入下一代双特异性免疫治疗药的良好候选者。
优先利用AAV ITR作为包装终端信号的定量分析
基因工程进步已导致重组腺相关病毒（RAAV）成为开发有效基因疗法的宝贵工具。RAAV的生产容易受到脱靶异质包装的影响，其影响仍在理解。在这里，使用粘附和悬浮液HEK293细胞同时生产具有四基因组长度的RAAV载体，以了解5'ITR终止。AAV8载体是由人FVIII质粒产生的，用于具有特定截断的4,707个核苷酸的全长货物，从而产生较小的基因组。通常，Raav的特征是将空的衣壳与全帽夹区分开，但是对于这项工作，该描述是不完整的。这项研究中的小基因组的特征是电荷检测 - 质谱法（CD-MS）。使用CD-MS，在常规归因于部分的范围内的包装基因组得到解析和定量。此外，碱性凝胶和QPCR用于评估包装基因组的身份。一起，这些结果显示了要封装的单位长度基因组的倾向。包装的基因组是作为从5'ITR发出的复制中间体发生的，表明HEK293细胞更喜欢单位长度基因组，而不是5'ITR终止和先前从SF9 Cell Systems观察到的5'ITR终止和异构DNA包装。由于两种制造过程均已使用并不断评估以生产临床材料，因此这种理解将使RAAV设计用于基础研究和基因治疗。
Wuxiatm细胞系开发过程
Wuxi Biologics提供快速细胞系开发（CLD）时间表，并从我们的Wuxia Cho-K1平台中产生高滴度，质量和稳定性。我们的平台使我们的合作伙伴能够快速迈向IND归档，并提供适合大规模商业生物制造的经济高效的蛋白质表达系统。以下是使用所有内部功能的Wuxia CLD平台的典型工作流程，即使利用了其他哺乳动物细胞系蛋白表达系统，也可以利用此过程（例如HEK293，NS0，Wuxia ADCC Plus TM，GS-Cho或其他Cho菌株）。
使用 24 孔板脂质体转染技术对含有 RNP 的永生化细胞系进行 CRISPR 编辑
本方案描述了如何将由纯化的 Cas9 核酸酶与化学修饰的合成单向导 RNA (sgRNA) 组成的核糖核蛋白 (RNP) 复合物递送至标准永生化细胞系（粘附或悬浮）。尽管针对 HEK293（人胚胎肾 293 细胞）进行了优化，但本方案可能适用于许多其他细胞系（例如 A549、U2OS、HeLa、CHO、MCF-7）。RNP 递送是使用 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ 转染试剂完成的。化学修饰的 sgRNA 旨在抵抗核酸外切酶的降解并防止可能导致细胞死亡的先天性细胞内免疫级联。本方案可用于转染 EditCo 的多向导基因敲除试剂盒。
新型抗癌食谱的综合杂种杂种作为潜在的Akt抑制剂
本研究文章介绍了香豆素 - 三唑 - chalcone的一系列新型混合类似物的合成，它们是潜在的生物活性剂，具有新型的抗癌治疗作用方式。这些化合物已通过醛醇冷凝和1,3-二极化的环加成合成，从而产生了结合了两个或多个药理的杂化杂环系统的产生。随后对合成化合物进行了筛查，以针对各种人类癌细胞系进行抗癌活性，包括A549（肺癌），HELA（子宫颈癌），PANC1（胰腺癌），HT1080（纤维肉瘤）和HEK293（HEK293）（人体伴侣肾细胞），体内。与其他化合物相比，与其他化合物相比，与其他化合物相比，与其他化合物相比，二硝基二硝基Chalcone 9a在3.1至7.02 µg/ml的范围内显示出明显的IC 50值。所有化合物9a-d对HEK-293细胞显示出更高的IC 50值，表明其对正常细胞的无毒性质。此外，在计算机方法中，已经采用了在MTT测定中针对分子靶标的活性化合物的功效。作者对蛋白质PI3K和AKT进行了对接研究，它们是胰腺癌，肺癌，宫颈癌和纤维肉瘤的常见靶向生物标志物，具有9A和一些已知的抑制剂。结果表明，化合物9a与Akt（–10.6）和PI3K（–10.3）具有良好的结合亲和力。然而，发现它对AKT更为特异性，因为其结合位点氨基酸相互作用与已知的AKT抑制剂相似。这些发现提供了证据表明，混合杂环系统可能对通过新颖的抗癌治疗方式开发潜在的生物活性剂有用。